Actions bactéricides d'une solution d'ions d'argent sur Escherichia coli, Étudié par énergie Filtrage
actions bactéricides de l'ion argent sur Escherichia coli comme micro-organisme du modèle ont été étudiées par microscopie électronique à transmission à filtrage d'énergie (EFTEM), électrophorèse bidimensionnelle (2-DE), et désorption laser assistée par matrice ionisation à temps de vol masse spectrométrie (MALDI-TOF MS). EFTEM observations ont démontré que l'ion argent infiltre facilement à l'intérieur de E. coli. contrairement au début du hypothèse selon laquelle il se trouve d'abord dans la zone de la membrane cellulaire. En outre, 2-DE et MALDI-TOF MS ont indiqué que l'expression d'une protéine de sous-unité ribosomale, ainsi que celle d'autres enzymes et protéines est affectée par l'ion argent. Les présents résultats démontrent pour la première fois que l'une des principales fonctions bactéricides de l'ion argent est son interaction avec le ribosome et l'inhibition de suivi de l'expression des enzymes et des protéines essentielles pour la production d'ATP.
Les détails expérimentaux sont les suivants. a été préparé par voie électrolytique une solution aqueuse ayant une concentration en ions argent de 900 ppb en appliquant un courant de 12,5 mA pendant 28 s entre les deux électrodes à plaque d'argent installées dans l'eau. La teneur en chlore résiduel dans l'eau était inférieure à 0,2 mg / litre. La concentration en ions argent dans la solution obtenue a été mesurée avec un Hitachi Z-5010 polarisée spectrophotomètre d'absorption atomique Zeeman. A titre de référence, une solution à 0 ppb a également été préparée, sans électrolyse.
En tant que micro-organisme modèle, E. coli Gram négatif NBRC-3972 a été utilisé. Dix millilitres de la suspension aqueuse à 10 7 à ~ 10 8 CFU / ml E. coli mis en réaction avec 90 ml d'une solution d'ions argent pendant 30 min, 3 h et 24 h. Les cellules viables ont été dénombrées sur une plaque de gélose contenant 1 g / litre de glucose, extrait de levure 2,5 g / litre et 5 g / litre de tryptone par le procédé de comptage des colonies, après incubation à 35 ° C pendant 24 h.
Pour l'observation morphologique et l'analyse élémentaire en utilisant EFTEM, cellules de E. coli qui a réagi avec l'ion d'argent ont d'abord été fixées dans 2% de glutaraldéhyde dans 0,1 M de tampon cacodylate de sodium à 4 ° C. Après avoir été lavé avec 0,1 M de tampon cacodylate, la suspension a été osmicated dans 2% de tétroxyde d'osmium à 4 ° C pendant 4 h et ensuite déshydraté de façon répétée avec des concentrations croissantes d'éthanol. Les cellules fixées ont été noyées dans une résine époxy à 60 ° C pendant 48 h et coupées en tranches dans un échantillon de EFTEM environ-50 nm d'épaisseur en utilisant un Leica EM UC6 ultramicrotome. L'échantillon a ensuite été revêtue d'un film de carbone amorphe. Il a également été positivement colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb pour l'observation morphologique.
La sonde d'électrons est focalisé à une largeur à mi-hauteur de 0,9 nm pour l'analyse élémentaire en utilisant la spectroscopie à dispersion d'énergie aux rayons X (EDX). Etant donné que le rapport signal-bruit est insuffisant pour la cartographie élémentaire, les données ont été acquises par place place avec un temps d'analyse de 2000 s par point. La position du faisceau est suffisamment stable dans la mesure où la dérive est inférieure à 1 nm lors de l'analyse.
Pour l'analyse protéomique utilisant de la 2-DE et MALDI-TOF MS, les suspensions de E. coli qui ont réagi avec 900 ppb et 0-ppb solutions d'ions argent pendant 3 h ont été utilisés. On a centrifugé les deux échantillons à 2.900 x g à 4 ° C pendant 20 min, et les précipités ont été mis en suspension dans du tampon de lyse et perturbé dans un tube de microcentrifugation immergé dans de la glace avec une sonde à ultrasons pendant 30 s. Après centrifugation à 1600 x g pendant 30 minutes, les surnageants contenaient des protéines hydrophiles solubles. La quantité de l'échantillon de protéine pour l'analyse a été fixée à 0,4 mg / ml en utilisant une méthode de dosage de protéine Bio-Rad.
Dans la première dimension, les protéines ont été séparées dans des gels avec un gradient non linéaire tout au long de 11 cm à gradient de pH immobilisé (IPG) allant de pH 3 à 10. Les gels IPG ont été réhydratées avec une solution de réhydratation de 185 pi contenant les échantillons de protéine à 20 ° C pendant 12 h. La focalisation isoélectrique a été réalisée en utilisant un système cellulaire Bio-Rad Protean IEF, avec la tension maximale à 8000 V.
La figure 2 montre les images zéro perte TEM des structures cellulaires obtenues avec des électrons émis élastiquement. Les cellules qui ont réagi avec une solution de 0-ppb pendant 24 h ont montré une morphologie normale de E. coli. avec une surface multicouche constitué de la membrane externe, la couche de peptidoglycane dans l'espace périplasmique, et la membrane cytoplasmique (Fig. 2A et B). Bien que les images TEM correspondants ne sont pas représentés, les cellules qui ont réagi avec une solution de 900 ppb pendant 30 min et 3 h indiqués morphologie apparemment normale, analogue à celle représentée sur la Fig. 2A et B sans dégradation perceptible dans les structures de membrane. En revanche, les cellules exposées à une solution de 900 ppb pendant 24 h montrent différentes phases du processus de mort cellulaire (Fig. 2C et D). Sur la Fig. 2C. ce qui correspond à un stade intermédiaire de la rupture des cellules, la plasmolyse et la disparition partielle de la membrane cytoplasmique sont observées. La structure de la membrane externe est apparemment non affecté à ce stade, et la cellule prend une morphologie déformée, à l'absence partielle de la membrane cytoplasmique. Sur la Fig. 2D. ce qui correspond évidemment à la dernière étape de rupture des cellules, la membrane externe est progressivement perdue et le cytoplasme a tendance à se répandre hors de la cellule.
Les résultats EDX (Fig. 3) montrent que, après un temps de réaction relativement court de 30 min, l'argent a déjà été détecté à l'intérieur de E. coli. Ceci est en contraste à la surface de la membrane cellulaire, où l'argent n'a pas été détectée malgré des mesures répétées à différents endroits. Il convient de noter que l'argent est détectée à l'intérieur de E. coli parfois, mais pas toujours, avec du soufre. Osmium et le chlore ont été détectés comme des artefacts dus à l'échantillon préparation. Les particules denses en électrons dans le cytoplasme observé sur la Fig. 2C sont dus à la condensation de tétroxyde d'osmium utilisé pour la fixation cellulaire, et ils ne sont pas des agrégats d'argent. Pour des temps de réaction prolongés de 3 et 24 h, la quantité d'argent accumulée estimée à partir EDX comptages à peine augmenté (données non présentées).
En conclusion, les actions bactéricides d'une solution d'ions d'argent sur E. coli ont été caractérisés par EFTEM, 2-DE, et MALDI-TOF MS. Il a été confirmé que l'ion argent infiltre facilement à l'intérieur de E. coli. plutôt que résidant dans la zone de la membrane cellulaire, comme observé par EFTEM. Une analyse ultérieure en utilisant du 2-DE et MALDI-TOF MS indiqué qu'une protéine de sous-unité ribosomale et des enzymes et des protéines ont été affectées par l'ion argent. Les résultats actuels indiquent que l'une des principales actions bactéricides de l'ion argent est causée par son interaction avec le ribosome et la suppression ultérieure dans l'expression des enzymes et des protéines essentielles à la production d'ATP. L'approche actuelle pourrait être étendue à d'autres études relatives à l'ion d'argent, comme les études de ses effets sur la viabilité des microbes avec une enveloppe cellulaire différente de celle de E coli.
La viabilité des cellules de E. coli en fonction du temps, à la suite de réactions avec 900 ppb et 0-ppb solutions d'ions d'argent. Les cellules viables ont été dénombrées sur une plaque de gélose contenant 1 g / litre de glucose, extrait de levure 2,5 g / litre et 5 g / litre de tryptone par le procédé de comptage des colonies, après incubation à 35 ° C pendant 24 h.