Comment corriger l'éclairage de fond en microscopie fond clair ImageJ Documentation Wiki

Cette section explique les méthodes pour faire la correction d'éclairage de fond en microscopie à fond clair.

correction de fond peut être appliquée pendant l'acquisition des images (a priori) ou après l'acquisition (a posteriori). La différence entre ces derniers est une correction a priori utilise des images supplémentaires obtenues au moment de la capture d'image alors que dans une correction a posteriori, les images supplémentaires ne sont pas disponibles et donc un modèle d'éclairage idéal doit supposer. Les méthodes a priori sont donc l'option préférée.

Lors de la numérisation des images, il existe plusieurs sources de dégradation de l'image à considérer:

Le bruit aléatoire. Cela est dû aux fluctuations décorrélés ci-dessus et en dessous des données d'image en conséquence à la nature des capteurs d'image. Ces fluctuations varient avec le temps (ils sont différents d'un plan à) et ils peuvent être réduits en moyenne de plusieurs images consécutives (en supposant que l'échantillon ne bouge pas et qu'il n'y a pas de vibration de l'équipement). Cependant la moyenne de l'image tend à adoucir l'image (à savoir un peu de flou avec une perte de netteté). L'ampleur de la réduction du bruit obtenu en calculant la moyenne est proportionnelle à la racine carrée du nombre d'images. Cela signifie que, pour réduire le bruit de moitié on a besoin en moyenne 4 images; pour le réduire à un quart de l'original doit en moyenne 16 images, et ainsi de suite.

bruit de motif fixe (les « points chauds ») est caractérisée par des intensités de pixels qui sont constamment au-dessus des fluctuations de bruit aléatoire et elle est due à des différences défectueux CCD ou pixel en charge débit de fuite (ce qui est aussi appelé « biais électronique » du capteur). bruit de motif fixe se manifeste lors de l'utilisation de longues durées d'exposition (par exemple en microscopie à fluorescence) et obtient plus accentué avec des températures plus élevées (c'est pourquoi sont refroidis certains appareils photo). Les « pixels » apparaissent sous forme de pixels lumineux dans l'image toujours dans la même position prises de vues effectuées dans les mêmes conditions. Ceux-ci peuvent être compensés par la soustraction de la soi-disant « Darkfield » (un coup de feu avec le trajet de la lumière obstruée, prises avec les mêmes paramètres que la prise de vue normale, voir ci-dessous).

L'intensité d'éclairage de fond fourni par l'optique de source lumineuse de microscope est le plus souvent pas homogène dans le champ de vision (le condenseur de microscope ne fournit pas toujours l'illumination « champ plat », il est courant d'avoir une tache lumineuse au milieu du champ).

Assurez-vous que votre source de lumière a un filtre infrarouge (parfois appelé « filtre thermique »).

Éteignez le gain automatique de la caméra (ou autoexposition). Si votre appareil photo ne peut pas désactiver la fonction de autogain (comme dans la plupart des webcams), la méthode décrite ici ne fonctionnera pas. De même, lors de l'utilisation d'un appareil photographique standard, il faut le mettre en mode manuel pour toutes les prises suivantes sont prises avec exactement les mêmes paramètres d'exposition.

Mettre l'échantillon sur la scène, concentrer l'objet, ajuster les filtres de densité neutre et / lumière condenseur, définir un temps d'exposition de l'appareil approprié.

Si l'appareil photo a une fonction de balance des blancs, l'appliquer maintenant sur le champ vide lumineux éclairé: tout d'abord prendre l'échantillon, puis appliquer la balance des blancs.

Vérifiez l'histogramme du champ lumineux pour vous assurer qu'il ne soit pas saturé et pas trop sombre. Si nécessaire, réajustez la lumière en conséquence (ou insérer / retirer des filtres de densité neutre) et appliquer à nouveau la balance des blancs.

Repositionner l'échantillon et vérifier à nouveau que l'histogramme de l'image ne soit pas saturé (trop de pixels aux extrémités noires ou blanches) et que les valeurs d'échelle de gris couvrent la majeure partie de l'espace d'échelle de gris (à savoir maximiser la gamme dynamique). Désormais, les réglages de la caméra et la lumière du microscope ne doivent pas être réglés plus.

Bloquer le trajet de la lumière (ne mettez pas la lumière du microscope au large. La plupart des microscopes ont un levier qui permet à l'utilisateur de bloquer le chemin de lumière au tube d'extension, où la caméra est) et une capture. Cette image sera presque noir partout, sauf pour les « pixels » (le cas échéant pixels parfois chaud ne sont pas très visibles, mais ils peuvent être vérifiés dans l'histogramme de l'image). Enregistrez l'image sous « Darkfield » qui sera utilisé pour compenser les pixels.

Ouvrez maintenant le chemin de la lumière, retirez l'échantillon (l'image est tout arrière-plan) et une capture. Enregistrer comme « Brightfield »; il sera utilisé pour compenser l'éclairage de l'arrière-plan.

Mettre l'échantillon sur la scène et la capture d'un seul coup. Enregistrer comme « spécimen ».

L'opération (dans un canal de 8 bits) consiste à calculer le coefficient de transmission à travers l'échantillon:

D'abord, nous allons compenser le biais électronique (pixels) dans les images et spécimens fond clair.

Utilisation de la commande Processus> ImageCalculator. calculer (Brightfield - Darkfield) et appeler le résultat « Diviseur »:

Faites la même chose avec l'image de l'échantillon: (spécimen - Darkfield) et appeler le résultat « Numérateur ».

On calcule ensuite le facteur de transmission comme étant le rapport de la lumière transmise à travers l'échantillon et la lumière incidente pour produire l'image corrigée. Autrement dit, la division des images: Numérateur / Dénominateur.

Le résultat de cette division est un nombre réel entre 0 et 1 (0 s'il n'y a pas du tout la lumière passant à travers l'échantillon, 1 si toute la lumière incidente passe à travers l'échantillon). Ce nombre ne peut pas être stocké dans un 8 bits par image de canal; au lieu de la valeur est à nouveau mis à l'échelle pour la gamme de 0 à 255 pour chaque canal en multipliant le résultat de la division par 255. Ceci est réalisé en une seule étape avec le plugin Calculator_Plus qui effectue la division, suivie d'une multiplication (et une somme si nécessaire ) tout en double précision avant de coller le résultat clipsé de nouveau dans une image:

Le résultat de ce qui devrait avoir un fond plat (même) qui doit apparaître blanc ou neutre (à moins que la lame de verre a une teinte notable) tant que vous ne modifiez aucun des paramètres de la caméra entre les prises (le temps, l'exposition, blanc équilibre, etc.) ou les réglages du microscope (lumière, condenseur, grossissement).

On peut améliorer le rapport signal / bruit en prenant des coups moyenne au lieu de les célibataires. Dans ce cas, les images à fond noir, fond clair et échantillons peuvent être créés comme la moyenne de plusieurs coups de feu. Si l'appareil photo ou le logiciel acquisition ne permettent pas de capture moyenne, on peut successivement capturer les images (le plugin IJ_Robot peut être utile pour automatiser cela), puis les convertir en une pile et enfin Z-projet de la pile en utilisant l'option d'intensité moyenne . Par exemple à la moyenne 16 coups de feu, saisir 16 images puis exécutez:

Le résultat « ZProjection de la pile » est l'image moyenne.

Plus de photos dans les mêmes conditions. prendre une nouvelle image spécimen (évidemment) et de réutiliser Diviseur et Darkfield.

Les changements d'agrandissement et / ou de l'éclairage du microscope. prendre un nouvel échantillon (évidemment), une nouvelle image Brightield et recalcule l'image Diviseur (vous pouvez réutiliser le fond noir).

Les changements dans les réglages de l'appareil photo. prendre toutes les images à nouveau.

Diverses méthodes ont été proposées pour extraire à partir d'une seule image les caractéristiques de l'arrière-plan. Par exemple:

Mettre en place une surface polynomiale à un certain nombre de points d'échantillonnage (qui ne contiennent pas de spécimen) dans l'image et l'utilisation de ce que l'image sur fond clair pour la correction comme ci-dessus. Au moins 4 plug-ins de mettre en œuvre ce principe:

Un plug-in par Bob Dougherty est également disponible pour le montage polynômes de Legendre (Polynomial_Fit. Vous devez mettre en œuvre la soustraction de la surface équipée),

Un plug-in par Michael Schmid (Fit polynomiale). Ceci a l'avantage d'utiliser le seuil pour sélectionner les zones de l'image à être monté et soustraire la surface ajustée si on le souhaite.

Un module de Cory Quammen (Retrait arrière-plan non uniforme) trouve un ajustement des moindres carrés d'échantillons d'arrière-plan dans l'image à l'un des deux profils d'intensité: un plan ou d'un polynôme cubique 2D.

Utiliser une méthode morphologique tel que l'algorithme « boule roulante » [Sternberg S. traitement d'image biomédicale, IEEE Computer 1983; 16 (1): 22-34]. Cela a été mis en œuvre dans ImageJ comme processus> Contexte Soustraire. Cette méthode présente quelques artefacts d'image.

Cependant il faut savoir que toutes les méthodes rétrospectives font des hypothèses sur les caractéristiques de l'image qui sont peu susceptibles d'être strictement satisfaite dans une image arbitraire. Par exemple, il est impossible de différencier systématiquement une tache sombre diffuse en raison de la présence de taches d'une raison d'un éclairage inégal de fond. Il est toujours préférable de corriger les images avec une méthode a priori.

Avec seulement 1 image, il est difficile de savoir ce qui est du bruit et ce qui est la texture de l'image. On peut essayer de lissage de l'image (par exemple convolution gaussienne), mais cela affecte aussi la netteté des bords. filtrage médian est mieux à préserver les bords, mais affecte encore l'image avec une perte de détails.

Avec seulement 1 image disponible, une solution possible est de remplacer uniquement les pixels avec la moyenne de ses voisins sans la moyenne du reste des pixels.
Voici une macro qui implémente cette idée. On notera que les pixels ne doivent pas être regroupés et ils devraient être saturés [value = 255 à 8 bits des images en niveaux de gris ou dans les 8 canaux de bits d'images RGB]. Si les pixels ne sont pas saturés, vous pouvez les seuil (faire les pixels = 255 et les pixels restants = 0 et l'ajout de cette image seuillée à l'original (ce qui sature les pixels) .Si il y a des zones blanches qui ne ont pas besoin débruitage, on peut soustraire une première à l'ensemble de l'image puis saturer les pixels (de sorte que les pixels ont une valeur de 255 et les zones blanches 254).