Comment faire pour obtenir le meilleur ADNc pour l'isolement de gènes - Bitesize Bio
ADNc (ADN complémentaire) est un outil extrêmement utile - doué pour les biologistes moléculaires par des virus à ARN, qui heureusement « inventé » l'enzyme transcriptase inverse qui nous permet de faire les choses.
virus ARN utilisent cette ADN polymérase dépendante de l'ARNm pour convertir leur génome simple brin en ADN double brin pour l'intégration dans le génome de leur hôte. Mais dans le laboratoire, il peut être mise à profit pour faire des copies d'ADNc à partir de modèles d'ARNm. Cela signifie que la transcriptase inverse peut être utilisé synthétiser une copie d'ADNc de chaque ARNm qui est présent dans un extrait d'ARNm, et qui est une chose très utile pour être en mesure de le faire.
Avantages de l'ADNc sur l'ADN génomique
Du fait de ces copies d'ADNc, vous pouvez faire des choses comme PCR amplifient un gène d'intérêt, ou faire une banque d'ADNc et sonde pour une séquence ou une activité spécifique. Il y a plusieurs avantages à utiliser l'ADNc par opposition à l'ADN génomique pour ce faire:
- Aucun introns: les gènes eucaryotes contiennent souvent des introns (séquences non codantes). Ceux-ci sont éliminés après la synthèse de l'ARNm afin ADNc ne contient pas d'introns. Cela signifie qu'une copie d'ADNc d'un gène peut être isolé sous forme d'un seul fragment sans intron. Prokaryotes n'ont pas introns si ce n'est pas un problème si vous travaillez avec des gènes bactériens.
- Plus modèle: Il y a plusieurs copies d'ARNm pour chaque copie dans le génome, signifie que vous obtiendrez plus de copies par cellule de la séquence d'intérêt.
- Moins séquence de fond: Parce que seulement les séquences qui ont été exprimées en ARNm seront présents dans une préparation d'ADNc, il y a moins de séquence d'arrière-plan par rapport à l'ADN génomique, ce qui le rend moins probable que vos amorces se lient de manière non spécifique.
Ce sont les bases, mais pour le reste de cet article, je me concentrerai sur un sujet qui pourrait concerner ceux d'entre vous qui ont besoin d'isoler des gènes avec des profils d'expression spécifiques aux tissus. Pour cela, vous devez synthétiser l'ADNc du complément entier ARNm de votre tissu de choix puis utiliser comme un modèle pour amplifier votre gène cible.
Mais comment choisir le tissu droit d'isoler votre ADNc à partir? Je vais vous dire comment. Se tromper et vous pourriez avoir à repenser votre stratégie - Je vais vous dire comment faire cela aussi.
Comment choisir une bonne source pour faire de votre bibliothèque d'ADNc
L'ARNm utilisé pour fabriquer l'ADNc est extrait à partir de différents tissus de l'organisme (par ex. Le cerveau, les reins, le foie), ou moins fréquemment de cellules en culture (par exemple,. Les cellules HeLa). ADNc représente le pool de gènes exprimés dans un tissu et étant donné que chaque organe a une fonction différente dans le corps, chaque tissu a différents niveaux d'expression de chaque gène. Donc, avec tant de tissus à choisir, quel est le meilleur ADNc de tissu à utiliser pour isoler votre gène?
La réponse courte est celle qui a plus haut niveau d'expression de votre gène. Le plus abondamment le gène est exprimé dans le tissu, plus il est probable que vous isoler votre gène par PCR, car il y a plus de modèle pour amplifier.
Avoir un Go au PCR
Si vous ne recevez pas la bande nécessaire, tout d'abord essayer d'optimiser la réaction PCR lui-même. Des additifs tels que bétaïne peut aider et donc peut cette liste de dépannage PCR. mais si cela ne donne pas de résultats - et ensuite?
Ajouter plus d'ADNc modèle
La raison la plus courante pour l'isolement réussi d'une cible à partir d'ADNc est que l'ADNc ne contient pas assez de la cible pour l'amplification réussie. Ajout de plus modèle pour augmenter la concentration de la cible fonctionne souvent, mais habituellement une nouvelle ADNc est l'approche qui doit être prise. Si cela ne fonctionne pas, cela pourrait signifier que votre gène cible est mal exprimé, ou même pas du tout, dans le tissu que vous avez sélectionnés ...
Essayez un tissu plus spécifique
Une astuce pour isoler des cibles difficiles consiste à utiliser un ADNc d'une région plus spécifique du tissu que vous avez utilisé. Si vous pensez à ce sujet, un organe (par exemple. Cerveau) est composé de plusieurs parties fonctionnelles (par exemple l'hippocampe, l'hypophyse, hypothalamus) et l'expression d'un gène dans un ADNc entier est simplement l'expression moyenne de toutes les parties de cet organe.
Intuitivement alors, il va toujours faire partie plus spécifique de l'organe qui a une expression plus élevée de votre gène. Trouver des données d'expression sur des domaines plus spécifiques d'un tissu ou même de trouver des sources disponibles dans le commerce des zones spécifiques d'un organe peut être difficile.
Essayez un tissu lié
Une autre approche est d'essayer un tissu « lié », comme je l'aime à l'appeler. Une fois que je un gène qui était censé être exprimé dans le cerveau, mais je ne pouvais pas l'isoler du cerveau ou d'autres plus spécifiques. Donc, j'ai utilisé un tissu « lié », à savoir la rétine d'ADNc, parce que l'œil / rétine, un peu comme le cerveau, est principalement le tissu nerveux. Faible et voici, je suis une bande à partir d'ADNc belle rétine.
La plupart des exemples de tissus « connexes » entrent dans la catégorie des apparentement « systèmes ». Voici une liste des tissus qui font partie des différents systèmes qui pourraient être utilisés pour isoler votre cible:
S'il y a trop de tissus pour essayer à la fois, la piscine les cDNA en une seule réaction. Le but de l'ADNc mise en commun est de réduire le nombre de réactions qui doit être effectuée. Si vous allez à la piscine ADNc cependant, assurez-vous que vous ne pas diluer chaque ADNc. Au contraire, ajouter la quantité de chaque ADNc dans la réaction groupée comme vous le feriez dans une seule réaction. Cela garantit la cible dans les tissus abondants ne sont pas diluée, ce qui compromet le succès de la réaction.
Obtenez votre (Boss?) Carte de crédit Out
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