Détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) d'agents anti-bactériens par dilution de bouillon

introduction

dilution de bouillon est une technique dans laquelle récipients contenant des volumes identiques de bouillon avec une solution antimicrobienne dans incrémentielle (généralement géométriquement) des concentrations croissantes sont inoculés avec un nombre connu de bactéries.

Microdilution indique la performance du test de dilution de bouillon dans des plaques de microdilution d'une capacité de ≤ # x200a; 500 pi par puits.

Les méthodes décrites dans le présent document sont destinés principalement à l'essai des cultures pures de bactéries aérobies qui sont facilement cultivées par une nuit d'incubation sur gélose et qui poussent bien dans un bouillon Mueller-Hinton avec une supplémentation minimale. Les méthodes de dilution de bouillon décrits dans le présent document sont essentiellement les mêmes que celles utilisées, Allemagne [2], Suède [3], le Royaume-Uni [4], et les États-Unis [5] dans de nombreux pays dont la France [1]. Toutes ces méthodes sont basées sur celles décrites par Ericsson et Sherris [6].

Cations complété le bouillon de Mueller-Hinton est le moyen le plus largement utilisé au niveau international pour les méthodes de dilution de bouillon. Il permet une bonne croissance de la plupart des agents pathogènes et non exigeants est généralement faible en antagonistes. bouillon Mueller-Hinton qui répond aux exigences de la norme NCCLS [5] est considéré comme le milieu de référence.

Les suppléments ne doivent pas être utilisés à moins que nécessaire à la croissance de l'organisme d'essai. Différents suppléments ont été utilisés pour les organismes pointilleux et les données comparatives sur les performances sont nécessaires. sang défibriné ou lysés (LB) est couramment ajouté à 3-5% v / v pour les streptocoques fastidieux. LB à 3-5% et 20 mg / L β-NAD sont couramment ajoutés pour Haemophilus spp.

Agents antimicrobiens

poudres pures antimicrobiens doivent être obtenus directement auprès du fabricant ou de sources commerciales. L'agent doit être fourni avec un numéro de lot, la puissance (ig ou unités internationales (UI) par mg poudre, ou en pourcentage de l'ingrédient actif), une date d'expiration et les détails des conditions de stockage recommandées. poudres dans des récipients fermés dans l'obscurité à 4 ° C avec un déshydratant, sauf indication contraire recommandé par le fabricant. Idéalement, les agents hygroscopiques devraient être distribués dans aliquotes, dont un est utilisé à chaque fois de test. Laisser les cartouches se réchauffer à la température ambiante avant de les ouvrir pour éviter la condensation de l'eau sur la poudre.

Préparation des solutions mères

Utiliser une balance analytique calibrée pour peser les agents antimicrobiens. Provision pour la puissance de la poudre peut être effectué par utilisation de la formule suivante:

Les concentrations de solutions mères devraient être 1000 mg / L ou plus, bien que la solubilité de certains agents limiterons. Les concentrations réelles de solutions mères dépendra de la méthode de préparation des solutions de travail. Les agents doivent être dissous et dilués dans de l'eau distillée stérile à moins que le fabricant dispose autrement. Certains agents nécessitent d'autres solvants (tableau 1).

Table 1. Solvants et diluants pour la fabrication de solutions de réserve d'agents antimicrobiens qui nécessitent des solvants autres que l'eau

La moitié du volume d'eau, un volume minimal de 0,1 m d'acide lactique ou 0,1 m
HCl pour dissoudre, puis compléter un volume total d'eau.

Préparation des solutions de travail

dilution Broth

Le tableau 2 illustre une méthode de préparation de ces dilutions. Un minimum de 1 ml de chaque dilution par tube ou flacon est nécessaire pour l'essai. Etant donné que l'agent antimicrobien est généralement dilué dans un bouillon stérile puis mélangé avec du bouillon inoculé avec des microorganismes, on prépare des dilutions à deux fois la concentration finale souhaitée.

Tableau 2. Préparation des dilutions d'agents pour une utilisation dans des tests de sensibilité de dilution de bouillon. Modifié d'Ericsson et Sherris [6]

antimicrobiens
concentration (mg / L)
dans la solution mère

Volume stock
solution (ml)

microdilution

Préparation de l'inoculum

méthode de culture Broth

Procédé de suspension des colonies

Les cultures doivent être inférieures à 30 h vieux. Les colonies sont touchés par une boucle et la croissance transférée au bouillon ou du sérum physiologique stérile. La suspension est ajustée pour donner un équivalent de turbidité à celle d'un standard McFarland 0,5, comme décrit ci-dessus pour la méthode de culture en bouillon.

Pour tous les organismes de la concentration précise de cellules dans l'inoculum final dépendra de l'état de la culture. Cet effet est plus prononcé pour les organismes exigeants tels que Haemophilus spp. et Streptococcus pneumoniae où l'utilisation des cultures âgées peut réduire de manière significative le nombre de cellules viables dans la suspension. Une suspension ajustée correctement préparé par deux méthodes contiendra environ 1,5 × 10 8 cfu / ml pour les organismes les plus couramment isolées. D'autres méthodes qui produisent de manière fiable l'inoculum correct sont également acceptables. Les laboratoires doivent assurer l'exactitude de la méthode choisie. Plaques ou tubes doivent être inoculés dans les 30 min de la standardisation de l'inoculum pour maintenir la densité de cellules viables.

L'inoculum préparé ci-dessus est dilué dans du bouillon pour obtenir une densité finale de l'organisme de 5 × 10 5 cfu / ml (plage de 3 à 7 × 10 5 cfu / ml). La dilution nécessaire dépend de la méthode utilisée pour les essais, par exemple, transfert de 0,1 ml de suspension de l'organisme dans un tube contenant 9,9 mL de bouillon donne une densité d'inoculum de 1 x 10 6 cfu / ml qui, lorsqu'il est mélangé avec un volume égal de solution antimicrobienne dans des tubes ou des puits se traduira par un inoculum final de 5 × 10 5 cfu / ml. Pour produire un inoculum contenant 5 x 10 5 ufc / ml pour l'inoculation directe de panneaux secs préparés commercialement, transférer 50 pi de la suspension de l'organisme McFarland de 0,5 à 10 ml de bouillon. S. pneumoniae a été trouvé pour exiger le transfert de 100 ul de la suspension équivalent à 0,5 McFarland 10 mL de bouillon pour obtenir un inoculum finale de 5 x 10 5 cfu / ml.

Inoculation des tubes ou des plaques de microdilution

Un volume de suspension bactérienne (voir Préparation de l'inoculum) égal au volume de la solution antimicrobienne diluée (voir agents antimicrobiens) est ajouté à chaque tube, ou bien d'un agent antimicrobien. inoculateurs commerciales sont disponibles pour l'inoculation des plaques de microdilution. généralement des panneaux séchés disponibles dans le commerce nécessitent une reconstitution avec de 50 ul à 200 ul par puits de l'organisme dans un bouillon approprié. Si vous utilisez un de ces systèmes, suivez les instructions du fabricant.

Il est recommandé qu'une vérification de la pureté est effectuée sur l'inoculum en plaquant un échantillon sur une plaque de gélose et une nuit d'incubation non sélective.

L'incubation des tubes et des plaques de microdilution

des tubes de macrodilution doivent être coiffés et des plaques de microdilution scellées dans des sacs en polyéthylène ou munis d'un couvercle étanche ou un joint adhésif avant l'incubation afin d'éviter la dessiccation.

Incuber les tubes ou les plaques à 35-37 ° C dans l'air pendant 16 à 20 h pour la plupart agent antimicrobien / combinaisons de l'organisme. Le temps d'incubation devrait être étendue à 24 h lors du test Haemophilus spp. et streptocoque et avant d'interpréter les résultats des suspects staphylocoques résistants à l'oxacilline ou glycopeptide entérocoques résistants à. L'incubation à 30-35 ° C augmentera la probabilité de détection de la résistance oxacilline et doit être utilisée si les tests de sensibilité oxacilline.

Afin d'éviter un chauffage inégal ne pas empiler des plaques de microdilution plus de quatre haut. Les plaques et tubes ne doivent pas être mis en incubation dans une atmosphère de CO2 enrichi.

Résultats de la lecture

Les résultats ne doivent être lus quand il y a une croissance suffisante de l'organisme d'essai (par exemple bouton évidente ou la turbidité définie dans le contrôle de la croissance positive), pas de croissance dans le contrôle de la croissance non ensemencés ou négative (le cas échéant) et quand une plaque de pureté montre que le test organisme était pur. La quantité de croissance dans chaque tube ou bien est comparée à celle du témoin de croissance positive et la MIC enregistrée comme étant la concentration de l'agent qui inhibe complètement la plus faible croissance, ou, pour les sulfonamides, la plus faible concentration qui inhibe 80% de la croissance. Lors de tests de sensibilité aux glycopeptides des entérocoques, une turbidité faible doit être considérée comme la croissance.

Test de micro-organismes exigeants

Supplémentation du milieu de croissance est nécessaire, comme décrit ci-dessus. Lors du test de micro-organismes exigeants un organisme de contrôle de la qualité appropriée doit également être testé.

mics oxacillin sur staphylocoques

La résistance à l'oxacilline peut être difficile à détecter. Les conditions suivantes aideront la détection de souches résistantes:

1 L'incorporation de NaCl à une concentration finale de 2% p / v dans le bouillon.
2 Utilisation du procédé de suspension directe pour la préparation de suspensions bactériennes plutôt que la méthode de croissance.
3 L'incubation des essais pendant 24 h.
4 la température d'incubation d'au plus 35 ° C.

Tests sur les organismes producteurs de β-lactamase

Contrôle de qualité

Tableau 3. MICs cibles (mg / L) pour les organismes de contrôle en cation ajusté le bouillon de Mueller-Hinton

Escherichia coli
ATCC 25922
NCTC 12241
CIP 76,24
DSM 1103

Escherichia coli
ATCC 35218
DSM 5564

Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
NCTC 12934
CIP 54,127
DSM 1117

Staphylococcus aureus
ATCC 29213
NCTC 12973
CIP 103429
DSM 2569

Enterococcus faecalis
ATCC 29212
NCTC 12697
CIP 103214
DSM 2570

ATCC, American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, États-Unis.

NCTC, Collection Nationale de Cultures Type, Laboratoire central de santé publique, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT.

DSM, Deutsche Stammsammlung fûr Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweg, Allemagne.

Pour la fosfomycine, le bouillon doit être complété avec du glucose-6-phosphate 25 mg / L. dilution Agar est la méthode de choix pour cet agent.

Une souche QC pertinente doit être testée chaque jour spécimen test est effectué. Toutes les souches doivent être exécutées quand il y a un changement dans le lot de bouillon ou d'un panneau d'essai.

colonies d'essai des cultures de contrôle de la même manière que les cultures de routine. Revenu intermédiaire d'organismes de contrôle doivent être dans une double dilution des valeurs indiquées dans le tableau 3. Si les PRI sont utilisés pour les tests de sensibilité de routine pas plus de 5% des résultats de contrôle de la qualité pour une combinaison agent antimicrobien / organisme devrait tomber en dehors des plages prévues et correctives l'action, comme la vérification de la densité d'inoculum, est nécessaire si cette limite est dépassée. En outre les éléments suivants sont recommandés:

1 Tout contrôle sans agents antimicrobiens doit montrer une bonne croissance des souches de test et de contrôle.
2 Un échantillon d'inoculum doit être plaqué sur un milieu gélose approprié pour assurer qu'elle est pure.
3 Vérifiez occasionnellement la densité d'inoculum en effectuant les numérations viables.
4 Veiller à la lecture cohérente des points finaux par tout le personnel de lecture indépendamment une sélection de tests.