FAQ Aide technique pour l'amélioration Argent
- Guide d'étiquetage Gold nanoparticule
Description détaillée de l'étiquetage nanoparticule d'or, trucs et astuces pour conjugaisons avec succès, l'isolement des conjugués, et la façon de calculer l'étiquetage.
Ce qui activateur d'argent dois-je utiliser - argent HQ ou LI argent?
Cela dépend des considérations qui sont plus importantes pour vous. HQ argent est destiné à donner la taille de particule la plus uniforme: il possède un agent épaississant de protection (similaire au procédé Danscher) qui a été trouvée pour modérer le processus d'amélioration d'argent. Son pH est plus proche de la neutralité et sa force ionique est faible, que certains chercheurs croient améliore la préservation ultrastructurale. LI argent est plus pratique à utiliser (il est un réactif à deux composants, tandis que HQ argent est un kit 3-bouteille) et la réaction est plus lente, ce qui permet un plus grand contrôle. Il est également plus stable à la lumière.
Comment puis-je réduire le signal de fond?
- Assurez-vous que tous les échantillons sont lavés à fond avec de l'eau désionisée ultrapure ou avant la mise en valeur d'argent: halogénure ou d'autres anions précipitant l'argent va provoquer un précipité à la forme, qui lui-même est visible dans l'EM et se nucléée coloration de fond supplémentaire.
- les échantillons de lavage avec un agent chélateur avant la mise en valeur d'argent. Nous utilisons habituellement EDTA disodique (0,05 M, pH 4,6) sur des buvardages que le dernier lavage avant d'ajouter le réactif d'amplification de l'argent.
- verrerie propre (pour le mélange des réactifs, la manipulation des échantillons ou des exhausteurs de stockage d'argent) avec la solution de Farmer pendant au moins 20-30 minutes. La solution de Farmer consiste en 9 parties de 10% de thiosulfate de sodium avec une partie de 10% de ferricyanure de potassium.
- Utiliser des pinces en plastique ou téflonisées (non métalliques) et des outils pour la manipulation des échantillons.
Il existe deux approches pour réduire la coloration de fond: (a) modifier les conditions expérimentales, avant et pendant la mise en valeur de l'argent; ou (b) améliorer la « arrêt » de la réaction d'amélioration d'argent ou d'appliquer de nouveau après le développement est terminé.
Réduction de fond pendant la réaction
Dans les expériences avec la fluorescéine et de la sonde combinée Nanogold® FluoroNanogold, il a été constaté que le lavage avec 0,02 M de tampon citrate de sodium, pH 7,0, avant la mise en valeur d'argent donne milieux significativement plus bas que beaucoup d'autres traitements. Cela a été trouvé pour être efficace lorsque l'amplificateur d'argent Danscher a été utilisé pour le développement. Lorsque Nanoprobes HQ argent a été utilisé, 0,02 M de tampon citrate de sodium à pH 3,5, immédiatement avant la mise en valeur d'argent a fond inférieur. En immunoblots, nous constatons que 0,05 M EDTA disodique, pH 4,6, avant la mise en valeur d'argent contribue également à minimiser fond.
L'addition d'une petite quantité de détergent Tween-20 dans le tampon d'incubation Nanogold® aide à empêcher des interactions hydrophobes, qui peut être une autre source de la liaison non spécifique. Si l'échantillon peut tolérer, lavage avec 0,6 M tampon de bicarbonate de triéthylammonium, dans lequel Nanogold® est très soluble, peut également fond inférieur. Préparation d'un tampon de bicarbonate de triéthylammonium est décrit dans la référence suivante:
- Safer, D .; Bolinger, L. et Leigh, J. S .; J. Inorg. Biochem. 26. 77 (1986).
Les réactions « Stop » et le développement de retour:
- 1% d'acide acétique.
- 1% d'acide acétique suivie par fixateur photographique (AGEFIX, Agfa-Gevaert, ou Ilfospeed 200, Ilford).
- fix photo directe, en utilisant les nous venons de parler.
- bref rinçage dans 2,5% de chlorure de sodium.
- 15-25% de thiosulfate de sodium aqueux plus 15% de sulfite de sodium.
- 1% d'acide acétique, lavages dans du tampon acétate, tonifiant à 0,05% HAuCl4 3-10 min, avec un excès d'argent enlevé avec 3% de thiosulfate de sodium. Nous avons trouvé que les protéines marquées Nanogold sur un gel de polyacrylamide maintenus faibles bruits de fond à l'arrêt avec 10% d'acide acétique avec 10% de glucose dans de l'eau, par opposition à juste un arrêt de l'eau.
Ces méthodes, ainsi que leurs références, sont discutés dans notre revue récente de la technologie Nanogold®: