Labtimes Trucs et astuces de la technique dot blot simple et bon marché du commerce

Au cours de ma thèse de diplôme, qui a été supervisé par Thomas Arendt et Wolfgang Härtig à Paul Flechsig Institut de recherche sur le cerveau à Leipzig, en Allemagne, je devais quantifier les protéines du cerveau telles que tau et doublecortine. Comme il est généralement fait par Western Blot, j'ai vérifié tous les protocoles disponibles occidentaux et travaillé dur pour les faire fonctionner. Cependant, autant que j'ai essayé, certaines voies ne voulaient pas développer et d'autres sont restés sans tache après le décapage de la membrane - même quand je le même anticorps.

Pour résoudre ces problèmes, j'ai d'abord testé différentes conditions d'incubation d'anticorps. I obtenu une meilleure coloration par agitation de la membrane de transfert plus dur dans la solution d'anticorps. Malheureusement, cela a conduit à la consommation d'anticorps très élevé, donc je changé ma stratégie et a commencé à laisser incuber buvard des confettis de membrane dans 96 puits des plaques. Je laisse un cycle de gel de acryamide de quelques millimètres, transféré les protéines sur une membrane PVDF et couper la membrane en « voies » simples avec un scalpel et on les transfère les confettis dans un 96 puits de la plaque. En fait, je coloration stable a réalisé un quand je fis toutes les étapes d'incubation nécessaires dans ces plaques.

Cependant, deux problèmes demeurent. Tout d'abord, les voies étaient trop larges pour entrer dans les puits dans une seule pièce. D'autre part, ayant 34 échantillons, afin de permettre au moins une détermination de 4 fois, a fait produire les confettis à membrane de cette façon aussi laborieuse. Dispositif de transfert en point n'a pas été disponible dans le laboratoire et un essai de immunoarbsorbent lié à une enzyme (ELISA) a échoué en raison de la faible capacité de liaison d'antigène de plaques -ELISA par rapport à des membranes de PVDF. Mise en place des plaques ELISA avec un anticorps de capture a été trop de temps et l'achat d'un ELISA sur mesure pour plusieurs milliers d'euros était impossible.

Alors, que pourrait-on faire? Après quelques autres expériences, j'ai développé une méthode dot blot alternative pas cher et plutôt facile de transférer des échantillons de protéines sur une membrane de PVDF recevant des taches de haute qualité.

Dans l'étape suivante, injecter directement les échantillons de protéines (solubilisés dans du tampon d'échantillon de Laemmli) dans le gel (2 pi par position) à l'aide d'une seringue micro (figure 1 E). Retirer la grille après avoir injecté tous les échantillons (figure 1 F) et couvrir la partie supérieure du gel avec une mince couche d'agarose pour empêcher toute fuite d'échantillon (figure 1 G). Retirer le gel de la boîte de coulée et la transfère dans un cadre d'électrophorèse (une boîte sans fond, par exemple préparé à partir du couvercle d'une ancienne zone de la pointe, voir la figure 1 H). Fixer le bloc de gel sur le cadre en utilisant un gel d'agarose (figure 1 I L) et nouer le cadre sur une cassette buvard adapté pour un transfert de Western du réservoir, avant de transférer les protéines pendant une nuit à 100 mA.