Préparation et stockage de la culture des médias
Préparation et stockage de la culture des médias
Précautions - médias déshydratés
Lumière
Humidité
La température et le temps
Préparation du milieu déshydraté
Reconstitution de milieu déshydraté
La stérilisation des milieux de culture
contrôles de stérilisation
effets surchauffe
Tableau des défauts et les causes possibles dans la stérilisation des médias
Préparation des milieux stérilisés
Stockage des supports préparés
Précautions dans l'utilisation et l'élimination des milieux préparés
Précautions - médias déshydratés
tests de contrôle de qualité laboratoire utilisateur sur des supports préparés
Les milieux de culture doivent être conservés à la température spécifiée, dans des conditions déterminées et non plus que les périodes de durée de conservation appropriées à chaque produit. Les conditions de stockage et la date d'expiration de chaque produit sont indiquées sur les étiquettes ou inserts de produits, mais les règles générales suivantes aidera à veiller à ce qu'ils soient conservés dans un environnement optimal. Lors du stockage de produits noter les dates d'expiration de la durée de conservation sur les étiquettes et utiliser les produits afin de leur lot / numéros de lot.
doivent être conservés tous les milieux de culture préparés et leurs composants abri de la lumière et l'exposition à la lumière solaire directe doit être évitée à tout moment.
des récipients en verre et de plastique scellés ne sont pas affectées par l'humidité normale de laboratoire. Les contenants ouverts de poudres déshydratées seront affectées par une forte humidité. Hot, salles de préparation des médias fumants ne sont pas des environnements appropriés pour stocker des conteneurs de milieux de culture; en particulier des conteneurs qui sont fréquemment ouverts et fermés. Une chambre froide adjacente ou une armoire de stockage adéquat sont des zones de stockage préférables.
La température et le temps
Les conditions de stockage de la température des milieux de culture et leurs composants varient considérablement. Les groupes de produits suivants vous aideront à différencier les différentes exigences.
Média culturel. Scellé, des contenants non ouverts doivent être conservés à la température ambiante 15 à 20 ° C. Les récipients ouverts doivent avoir le bouchon ou le couvercle avec précaution et en toute sécurité remplacé. Il est important que les conteneurs ouverts sont stockés dans une atmosphère sèche à la température ambiante. Durée de vie 1 à 5 ans.
Préparé Broth Media. À 2-8 ° C. Ne laissez pas les produits de geler. La durée de conservation de 6 mois à 2 ans.
Il est toutefois important de surveiller le stockage des plaques préparées par des tests de contrôle de qualité afin que toute détérioration peut être détectée et la période de stockage déterminée avec précision. Des tests simples de pesage de plaques fraîches et stockées détermineront le taux de perte d'humidité. La perte de poids supérieure à 5% indique une perte importante d'eau.
Kits de production de gaz. Conserver à 2-8 ° C dans un endroit sec. Ne pas stocker ces kits à une température plus élevée pendant de longues périodes. Durée de conservation 3 ans.
Les réactifs stériles. Conserver à 2-8 ° C, sauf magasin de sérum de cheval à -20 à + 8 ° C.
Disques de Susceptibilité. Conserver à -20 ° C, mais maintenir le stock de travail à 2-8 ° C. Durée de vie 1 à 2 ans.
Préparation du milieu déshydraté
Les conditions de stockage sont généralement indiquées sur l'étiquette du produit et doivent être suivies.
1 # 9; écrire sur l'étiquette la date de réception dans le laboratoire.
2 # 9; magasin comme indiqué sur l'étiquette; généralement inférieure à 25 ° C dans un endroit sec, à l'abri de la lumière directe, des autoclaves, des fours de séchage ou d'autres sources de chaleur.
3 # 9; Vérifier la date de péremption sur l'étiquette, certains médias ont une durée de conservation beaucoup plus courte que les autres.
4 # 9; Utiliser stock pour le numéro de lot / de lot. Ne pas ouvrir une nouvelle bouteille jusqu'à ce que la bouteille précédente a été vidé. Note sur l'étiquette la date du conteneur est d'abord ouvert. Après utilisation, assurez-vous que le récipient est fermé et bien revenir à la zone de stockage désignée.
5 n ° 9, commander le moyen d'une taille appropriée du récipient et en une quantité qui soit conforme aux exigences normales d'utilisation. Un milieu dans un grand récipient qui a été ouvert à plusieurs reprises se détériore au stockage. Jeter le moyen si la poudre n'est pas à écoulement libre, si la couleur a changé ou si elle semble anormal de quelque façon.
Reconstitution de milieu déshydraté
Des instructions complètes pour la préparation des milieux de culture sont données sur l'étiquette de chaque bouteille. En règle générale, il est sage de ne préparer que d'une semaine à l'exigence.
2 ° 9; Préparation du milieu dans un récipient environ deux fois le volume final du milieu pour permettre un mélange adéquat. Suivez les instructions données sur l'étiquette de chaque produit.
médias d'agar sans se dissoudre habituellement sur une légère agitation. Supports contenant de l'agar doivent être chauffés pour dissoudre la gélose avant autoclavage. Amener le milieu à ébullition sans roussir ou brûler. La plupart des milieux de culture nécessiteront la stérilisation finale dans un autoclave à 121 ° C pendant 20 minutes.
Le pH du milieu déshydraté a été ajusté par le fabricant de sorte que le pH final du milieu préparé est conforme à la spécification de l'étiquette lorsque le milieu a été refroidi à 25 ° C. Ne pas ajuster le pH des milieux déshydratés avant la stérilisation.
La stérilisation des milieux de culture
Bien que la stérilisation de milieux de culture est conduite de préférence dans un autoclave à vapeur à des températures comprises entre 121-134 ° C, il doit être reconnu que les dommages sont causés au support par le procédé de chauffage.
Le traitement thermique des milieux de culture complexes, qui contiennent des peptides, des sucres, des minéraux et des métaux entraîne la destruction des éléments nutritifs, soit par dégradation thermique directe ou par réaction entre les composants du milieu.
Les produits toxiques causés par chemooxidation peuvent également être formés pendant le traitement thermique. Il est donc important d'optimiser le processus de chauffage de sorte qu'un milieu est stérile après chauffage, mais un minimum de dommages est causé aux ingrédients du milieu. En règle générale, il est admis que de courte durée, les procédés à haute température sont plus létales pour les organismes et chimiquement moins dommageables que sont des processus plus long, plus basse température, par exemple 3 minutes à 134 ° C est préférable de 20 minutes à 115 ° C.
Une instruction générale pour la stérilisation de milieux de culture dans des volumes allant jusqu'à un litre à 121 ° C pendant 20 minutes est indiquée sur chaque étiquette. Autoclaves varient en performance, cependant, et les tests de thermocouple utilisant différents volumes de supports doivent être effectués pour déterminer le « de chaleur et « temps froid-bas ». Il sera essentiel de le faire lorsque les volumes de médias supérieurs à deux litres sont préparés. Afin d'éviter une surchauffe de grandes unités de volume de médias, les périodes « de chaleur » et « cool-down » sont normalement intégrés dans le 121 ° C le temps de maintien.
Le cycle de stérilisation peut être divisé en quatre étapes:
Etape 1 20 ° -121 ° C Temps de montée en température de chambre
Le temps de montée en température la chambre dépend de l'efficacité de l'autoclave (air de décharge / d'entrée de vapeur d'eau) et la taille de la charge dans la chambre. Le temps nécessaire pour cette étape est mesurée avec une sonde d'enregistrement située dans la soupape de décharge d'air située dans le fond de la chambre.
étape 2 <100°-121°C Heat penetration time of the medium container
Volume (ml) dans des flacons en verre # 9; Temps (min)
100 ml # 9; # 9; # 9; 19 min
500 ml # 9; # 9; # 9; 18 min
5000 ml # 9; # 9; # 9; 37 min
Ces temps supposent que les médias d'agar ont été dissous avant autoclavage. On suppose également que l'exposition maximale à la vapeur est possible. Ainsi, bien que la seule bouteille l00 ml nécessaire 12 minutes pour atteindre 121 ° C, lorsqu'il est placé dans une caisse avec d'autres bouteilles il a fallu 19 minutes et lorsqu'il est placé dans le centre de casiers empilés il a fallu 30 minutes.
Etape 3 121 ° -121 ° C Temps de maintien à la température prescrite
Le temps de maintien à 121 ° C dépend de (i) le nombre d'organismes présents à l'origine dans le milieu (ii) le nombre fractionnaire d'un organisme présumé présente après chauffage, par exemple N = 0,001 équivalent à une bouteille de 1000 bouteilles chauffées devenir contaminés (iii) la constante de vitesse de mort thermique de la présente organisme présumée à 121 ° C.
Les temps de détention recommandée sont:
Température (° C) # 9; 121 # 9; 126 # 9; 134
Temps (minutes) # 9; 20 # 9; 10 # 9; 3
Etape 4 121 ° - 80 ° C temps de refroidissement de la chambre pour atteindre 80 ° C
Le temps de refroidissement dépend de la taille de la charge dans la chambre et le taux de perte de chaleur à partir de l'autoclave. pulvérisations d'eau sont utilisés pour accélérer le refroidissement dans les stérilisateurs commerciaux, mais un contrôle très prudente est nécessaire pour éviter une fracture de la bouteille et la pénétration de la pulvérisation de refroidissement dans le milieu stérilisé. Ce dernier problème se produit lorsque le vide formé dans l'espace de tête pendant le refroidissement aspire le fluide de refroidissement contaminé le fil du capuchon et dans la bouteille.
Tous les autoclaves doivent être vérifiés à des périodes fixes de temps pour veiller à ce qu'ils fonctionnent efficacement. Les mesures physiques doivent être effectuées sur des lectures de température et de pression, la qualité de la vapeur doit être contrôlée, l'efficacité de l'air « près à la vapeur d'eau » pièges dans la base de l'autoclave doit être déterminée et les soupapes de sécurité vérifié. Les inspections obligatoires des autoclaves comme récipients sous pression sont normalement effectuées chaque année par des spécialistes selon les instructions des assureurs d'un tel appareil. Avec les petits autoclaves de laboratoire de cette inspection n'est pas obligatoire.
Les indicateurs chimiques montreront la température atteint ou dépassé et certains indiqueront le temps maintenu à la température spécifiée. Sous-autoclavage est généralement de soi parce que l'échec de détruire toutes les spores bactériennes naturellement présentes dans les milieux déshydratés (le « bioburden ») permettra la croissance aura lieu dans le milieu stocké ou mis à incuber. L'échec de la stérilisation doit toujours être suspectée lorsque la contamination des milieux préparés se produit avec les organismes sporogènes. Les indicateurs biologiques de stérilisation démontreront la capacité de l'autoclave pour détruire les spores bactériennes.
La surchauffe est une cause courante de dérive du pH, l'assombrissement, la précipitation, la mauvaise résistance du gel et une diminution des performances bactériologique. Ces effets peuvent également être produits si un « pool » concentré d'ingrédients au fond du récipient est chauffé. Tous les milieux de culture doivent être en solution avant la stérilisation. Cela permettra de réduire l'apparition de réactions de type Maillard (brunissement non enzymatique) se déroulant dans le milieu.
effets Surchauffe se produiront si les médias agar sont autorisés à gel dans des bouteilles et sont ensuite cuits à la vapeur pour faire fondre l'agar-agar. Ils se produiront également si les médias en fusion sont maintenus à 50 ° C pendant plus de 3 heures avant l'utilisation. support de gélose avec des valeurs de pH égales ou inférieures à 5,0 sont très sensibles à la surchauffe sous quelque forme que parce que l'agar est hydrolysé et ne parvient pas à la résistance du gel. Il est recommandé de stériliser l'agar des médias d'un pH inférieur à 5,0 séparément.
La plupart des difficultés de stérilisation des milieux de culture se produisent lorsque de grands volumes unitaires de médias (> 2 litres) doivent être traitées. La meilleure solution à ce problème est l'utilisation d'un préparateur de milieu de culture. Ces processeurs semi-automatiques, faites par le Nouveau-Brunswick et d'autres fabricants à surmonter le problème de la faible pénétration de la chaleur d'agar par une agitation continue ou agitation du milieu pendant la phase de chauffage. Ces Préparateurs réduiront considérablement le temps nécessaire pour la stérilisation à 121 ° C ou dans certains modèles à 134 ° C. Ils sont fortement recommandés en raison de leur rendement élevé et un minimum de dommages aux milieux de culture.
Tableau des défauts et les causes possibles dans la stérilisation des médias
test de pH effectuée au-dessus de 25 ° C. La surchauffe par la stérilisation prolongée, refusion ou période trop longue à 50 ° C. solution de milieu incomplet. l'eau de mauvaise qualité ou des conteneurs. stocké de manière incorrecte déshydrater moyenne ou au-delà de la durée de conservation indiquée.
l'eau de mauvaise qualité ou des conteneurs. Surchauffe ou un stockage prolongé à 50 ° C. valeur du pH incorrect. solution incomplète.