Suppression de la stratification des kératinocytes par un mutant dominant négatif de JunB sans cellule de blocage

introduction

Dans le présent document, nous avons examiné le rôle de l'activité AP-1 dans une lignée cellulaire de kératinocytes humains HaCaT, lorsqu'une structure épidermoïde stratifié a été formé dans une culture d'interface air-liquide. Le blocage de l'activité AP-1 par un mutant dominant négatif de JunB n'a pas modifié l'activité de prolifération cellulaire des cellules HaCaT, mais encore a supprimé la formation d'une structure à couches multiples épidermoïde dans une culture en 3D. De plus, l'activité était spécifique au mutant JunB, alors que le mutant dominant négatif c-Jun n'a pas eu une telle activité.

Ces résultats suggèrent que l'activité AP-1, qui est bloqué par le mutant JunB mais pas par le mutant c-Jun, a donc été nécessaire pour la formation d'une structure épidermoïde multicouche en raison de certains mécanismes encore inconnus autres que la croissance cellulaire règlement.

cellules HaCaT dans une culture en 3D à une interface liquide-air

JunBδN et c-JunδN ont dominantes des effets négatifs sur l'activité de PAP-1-luc

Pour étudier la fonction du facteur de transcription AP-1, nous avons généré des mutants de délétion de JunB et c-Jun, désignés comme JunBδN et c-JunδN, respectivement, qui manquait un domaine activateur de transcription N-terminale (1-147) (Fig. 2A). JunB, JunBδN ou c-JunδN ont été exprimées transitoirement dans les cellules HaCaT avec c-Jun ou c-Fos, comme indiqué sur la figure. 2B. Les effets sur les activités AP-1 ont été mesurées en utilisant pAP1-luc en tant que rapporteur. Les deux JunBδN et c-JunδN supprimé non seulement l'activité interne AP-1 dans les cellules HaCaT mais aussi l'activité AP-1 induite par voie exogène exprimé c-Jun ou c-Fos. Entre JunBδN et c-JunδN, JunBδN a donné un plus fort effet négatif dominant de c-JunδN en ce qui concerne l'activité AP-1 dans cet essai rapporteur. JunB faiblement augmenté l'activité endogène AP-1 de cellules HaCaT mais supprime les hautes activités AP-1 en présence de c-Jun et c-Fos exogène (Fig. 2B).

JunBδN et c-JunδN ont dominantes des effets négatifs sur l'activité de PAP-1-luc. (A) Représentation schématique des mutants de la famille AP-1 et de suppression utilisées dans cette étude. (B) JunBδN et c-JunδN supprimer l'activité de PAP-1-luc dans des cellules HaCaT. PAP-1-luc a été transfecté dans des cellules HaCaT, conjointement avec l'expression des constructions codant pour c-Jun, c-Fos, JunB, JunBδN et c-JunδN, comme indiqué. Les activités de luciférase ont été normalisées à l'activité β-galactosidase afin de corriger toute variation possible de l'efficacité de transfection. Toutes les valeurs représentent la moyenne ± écart-type (n = 3).

Nous avons ensuite établi des cellules HaCaT qui expriment de façon stable JunBδN et c-Jun, respectivement. Western blot a confirmé que HaCaT-JunBδN6 et les cellules HaCaT-JunBδN8 ont exprimé une protéine de JunBδN, et HaCaT-c-Jun2 et des lignées de cellules HaCaT-c-Jun12 exprimé exogène c-Jun (Fig. 3A), respectivement. L'utilisation de ces lignées cellulaires, l'activité AP-1 et l'activité sont (élément de réponse antioxydant) ont été mesurés par des dosages de luciférase. L'activité de l'AP-1 de lignées de cellules HaCaT-JunBδN6 et HaCaT-JunBδN8 a été supprimé de manière significative, tandis que les lignées de cellules HaCaT-c-Jun2 et HaCaT-c-Jun12 avaient une augmentation de l'activité AP-1 comme prévu (Fig. 3B). D'autre part, les lignées cellulaires JunBδN n'a pas supprimé l'activité de transcription entraînée ARE, suggérant la spécificité de l'effet dominant négatif sur l'activité de JunBδN AP-1 (Fig. 3C). Nous avons évalué ensuite les effets de JunBδN sur la croissance des cellules HaCaT. Les courbes de croissance sont présentés sur la Fig. 3D. En présence de 5% de FBS, aucune différence significative n'a été observée pour les courbes de croissance des cellules HaCaT par l'expression de JunBδN (Fig. 3D).

Mise en place de cellules HaCaT exprimant de manière stable c-Jun et JunBδN. (A) L'expression de c-Jun dans les cellules HaCaT-c-Jun2 et HaCaT-c-Jun12 et JunBδN dans HaCaT-JunBδN6 et les cellules HaCaT-JunBδN8. Les analyses de immunotransfert ont été réalisées à l'aide anti-FLAG et des anticorps anti-ß-actine. (B, C) l'activité de PAP-1-luc (B) ou de l'activité pNQO1-ARE-luc (C) dans HaCaT-c-Juin- et les cellules HaCaT-JunBδN. Les activités de luciférase ont été normalisées à des activités de ß-galactosidase pour corriger la variation possible de l'efficacité de transfection. Toutes les valeurs représentent la moyenne ± écart-type (n = 3). Les valeurs de P en comparaison avec des cellules HaCaT transfectées de manière fictive. * P> 0,05, ** P < 0.05. (D) Growth curves of HaCaT-c-Jun, HaCaT-JunBδN and Mock-transfected HaCaT cells. All cells were seeded in 6 well plates on day 0 (3 × 10 4 cells/well). All values represent the mean (n = 3). The number of cells in each cell line showed no significant differences with the Mock-transfected HaCaT cells except for HaCaT-c-Jun2 cells on day 6.

cellules HaCaT-JunBδN prolifèrent, mais jamais de créer une structure à plusieurs niveaux dans la culture 3D

Evolution dans le temps des activités de prolifération cellulaire et la stratification des cellules exprimant HaCaT c-Jun, JunBδN ou c-JunδN dans une culture 3D

Stratification de JunB- ou c-Jun knock down cellules HaCaT dans une culture 3D

la formation de tissu stratifié de JunB ou c-Jun abattre les cellules HaCaT dans la culture 3D. (A) JunB ou c-Jun renversent les cellules HaCaT ont été établies comme indiqué dans la section des procédures expérimentales. L'expression de JunB dans HaCaT-sh (JunB) 4 et HaCaT-sh (JunB) 8 cellules, et c-Jun dans HaCaT-sh (c-Jun) 9 et HaCaT-sh (c-Jun) 17 cellules ont été examinées par analyse immunoblot utilisant un anticorps anti-JunB, anti-c-jun, et des anticorps anti-ß-actine, comme indiqué. (B) HaCaT-sh (JunB) 4, HaCaT-sh (JunB) 8, HaCaT-sh (c-Jun) 9 et HaCaT-sh (c-Jun) 17 cellules ont été cultivées par un procédé de culture en 3D et comparés avec Mock HaCaT transfectées-sh (Luc) (témoin) et des cellules HaCaT-JunBδN8 à 7 jours après exposition à l'air.

Les gènes activés par une culture 3D

Les gènes activés par une culture en 3D en fonction de l'activité AP-1. Les cellules HaCaT et HaCaT-JunBδN faussement transfectées ont été cultivées sur des gels de collagène avec ou sans exposition à l'air pendant 24 h. Les gènes, les niveaux d'expression de ceux-ci sont améliorées après exposition à l'air, ont été inscrites dans une analyse de microréseau d'oligonucléotides en utilisant l'ARN total extrait de faussement transfectées des cellules HaCaT et les niveaux d'expression des gènes sélectionnés ont été confirmés par RT-PCR semi-quantitative. La dépendance AP-1 de l'expression génique a été examinée en utilisant des cellules HaCaT-JunBδN.

Discussion

Il est également intéressant de noter que l'exposition à l'air a augmenté l'activité AP-1. espèces réactives de l'oxygène (ERO) jouent un rôle essentiel dans la médiation de l'activation de JNK de longue durée. Par conséquent, le stress oxydatif provoqué par exposition à l'air est soupçonné d'activer l'activité AP-1. Nous avons tenté d'examiner si ASK kinase, qui est directement activée par les ERO, est impliqué dans cette voie, mais n'a pas pu obtenir des résultats définitifs à ce jour (données non présentées).

Procédures expérimentales

Les constructions d'ADN

knockdown ARNi à médiation de c-Jun ou JunB a été effectuée en utilisant le système pSUPER ARNi (Oligoengine). La séquence de ciblage de 19 pb a été 5'-AGATGGAAACGACCTTCTA-3 'pour c-Jun, 5'-GACCAAGAGCGCATCAAAG-3' et 5'-JunB CGTACGCGGAATACTTCGA-3 'pour la luciférase. HaCaT clones stables trasfected avec pSUPER.puro-sh (JunB), pSUPER.puro-sh (c-Jun) et pSUPER.puro-sh (Luc) (témoin) ont été sélectionnés et maintenus en présence de 1 pg / mL de puromycine (Sigma).

la transfection de l'ADN et analyse de luciférase

Les cellules ont été transfectées en utilisant le réactif de transfection FuGENE6 (Roche Diagnostics) suivant les recommandations du fabricant. Les clones stables HaCaT transfectées avec pcDNA3-FLAG-c-Jun, pcDNA3-FLAG-JunBδN, pcDNA3-FLAG-c-JunδN et pcDNA3 (Mock) ont été sélectionnés et maintenus en présence de 300 ug / ml de G418 (Gibco). activité AP-1 dans ces cellules a été déterminée par un système de dosage de rapporteur de luciférase (Promega) en utilisant un luminomètre (AutoLumat LB953, EG - G Berthold). les activités luciférase ont été normalisées pour l'activité ß-galactosidase, qui a été induit par le CH110 (Amersham) co-transfecté.

culture 3D

La coloration immunohistochimique

immunoblotting

test de croissance cellulaire

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à une densité de 3 x 10 4 cellules par puits au jour 0. Les nombres de cellules ont été comptées au niveau des points de temps indiqués à l'aide d'un hématocytomètre.

l'analyse des microréseaux d'oligonucléotides

Nous avons effectué une analyse de puces à ADN d'oligonucléotide en utilisant le système CodeLink (Amersham). cellules HaCaT dans le système de culture en 3D ont été cultivées avec ou sans exposition à l'air pendant 24 h. L'ARN total a été préparé à partir de couches de cellules HaCaT en utilisant l'ARN simple mini-kit (Qiagen). Biotinylé ARNc a été synthétisé suivant les protocoles du fabricant et hybridé à un génome entier BioArray humain. Les diapositives de tableau ont été traités avec streptavidine-Cy5 et analysées avec arrayWoRx e (précision appliquée).

La transcription inverse (RT) -PCR

La transcription inverse a été réalisée avec le kit de synthèse d'ADNc premier brin (Takara) en utilisant l'ARN total obtenu à partir de cellules HaCaT en culture en 3D comme matrice, et la PCR a été réalisée en utilisant les amorces énumérées comme suit:

Aldo-céto reductase famille1, membre B10, amorce sens: 5'-GTCACCCATACCTCACACAG-3 ', amorce inverse: 5'-AGCCATGCTTTTCTGTGATA-3'; Sélénoprotéine P, amorce sens: 5'-AGAGATCAAGATCCAATGCT-3 ', amorce inverse: 5'-CATCTTTGAGAGTCGTGAGA-3'; FABP4, amorce sens: 5'-TAGGTACCTGGAAACTTGTC-3 ', amorce inverse: 5'-ATATATCCCACAGAATGTTG-3'; FABP5, amorce sens: 5'-AGGCTTTGATGAATACATGA-3 ', amorce inverse: 5'-ATTGTTCATGACACACTCCA-3'; ligand de chimiokine 14 (cxcl14), amorce sens: 5'-GACGGGTCCAAATGCAAGTG-3 ', amorce inverse: 5'-CAGGCGTTGTACCACTTGAT-3'; β-actine, l'amorce sens: 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 ', amorce inverse: 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3'.

Remerciements

Nous sommes très reconnaissants envers les Drs NE Fusenig et M Yamamoto pour les cellules HaCaT et reporter pNQO1-ARE-luc, respectivement. Ce travail a été soutenu par la subvention en aide pour la recherche scientifique du Ministère de l'Education, Culture, Sports, Science et Technologie du Japon.