Addgene Création d'un stock de votre Glycérine Addgene plasmide
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Informations d'arrière-plan
les stocks de glycérol bactériennes sont importantes pour le stockage à long terme des plasmides. Bien que vous pouvez stocker votre ADN plasmidique à -20 ° C, de nombreux laboratoires créent également des stocks de glycérol bactériens de leurs plasmides. De cette façon, lorsque vous voulez faire de l'ADN plus de plasmide, le plasmide sera déjà dans votre souche bactérienne désirée et vous ne aurez pas besoin d'obtenir des cellules plus compétentes et retransformer.
Les bactéries sur une plaque de gélose LB peuvent être conservés à 4 ° C pendant quelques semaines. Cependant, si vous voulez stocker des bactéries pour un temps plus long, vous aurez besoin de constituer des stocks de glycérol. L'ajout de glycérol stabilise les bactéries congelées, la prévention des dommages aux membranes cellulaires et maintenir les cellules vivantes. Un stock de glycérol de bactéries peut être stocké de manière stable à -80 ° C pendant de nombreuses années.
Une fois que vous avez la croissance bactérienne, ajouter 500 ul de la culture pendant la nuit à 50 500 pi de glycérol% dans un tube supérieur vis 2 ml ou cryovial et mélanger délicatement.
Note: Faire la solution de glycérol à 50% en diluant le glycérol 100% dans dH2 O.
Remarque: Casser les tubes supérieurs ne sont pas recommandés car ils peuvent ouvrir de façon inattendue à -80 ° C.
Congeler le tube de réserve dans le glycerol à -80 ° C. Le stock est maintenant stable depuis des années, tant qu'il est maintenu à -80 ° C. Ultérieurs cycles de gel et de dégel réduisent la durée de vie.
Pour récupérer les bactéries de votre stock de glycérol, ouvrez le tube et utiliser une boucle stérile, pointe de cure-dent ou d'une pipette pour gratter quelques-unes des bactéries congelées hors de la partie supérieure. Ne laissez pas le dégel du stock de glycérol! Série de bactéries sur une plaque d'agar LB contenant l'antibiotique approprié.Faites pousser vos bactéries pendant la nuit à la température appropriée (conditions de croissance, y compris le numéro de copie et de la température de croissance, se trouve sur la page d'information de votre plasmide) pour isoler les colonies bactériennes individuelles prêtes pour inoculer les cultures de préparation de plasmide.
Conseils et FAQ
- Combien dois-je utiliser le glycérol?
La concentration optimale de stockage de glycérol à long terme est inconnue. La plupart des laboratoires bactéries magasin à 15-25% de glycérol. stocke Addgene toutes nos bactéries dans 25% des stocks de glycérol.
Non! Gagnez du temps et de préparer le stock de glycérol en même temps que vous isolez votre ADN plasmidique. Le matin, lorsque vous reprendrez votre culture bactérienne liquide, prendre de la culture à 500 pi faire votre stock de glycérol avant de commencer votre miniprep.
Essayez de ne pas geler / dégeler votre stock de glycérol trop de fois. À Addgene, quand nous voulons croître plus d'un plasmide, nous plaçons le stock de glycérol sur la glace sèche en ensemençant sur agar LB afin qu'il ne dégèle jamais. Nous resequence notre stock après 100 utilisations.