Construire une meilleure bactérienne Glycérine Stock - Microbial Pharm
Assurez-vous d'avoir les éléments suivants qui ont été stérilisés ou autoclavés d'une certaine façon:
-LB Les plaques avec un antibiotique approprié
-les stocks liquides d'antibiotiques appropriés
-boucles stériles
-Maître Stock * Glycérine
-Cellules compétentes *
-* Expression plasmide
-Culture Flask avec bouchon Filtré
-Terrific Broth stérile contenant 0,5% de glucose (poids / volume)
-30% W / V stérile Solution Glycérine - Chilled
-Stérile cuve de remise en suspension, dépendante de la quantité totale des stocks de glycerol étant réalisée (Je ne fais pas habituellement plus de 20 à 40 à la fois afin que j'utilise habituellement un tube conique de 50 ml stériles)
-Stérile Cryo-Vials (habituellement 1,2 ml)
-Pipettes sérologiques
(* Si un stock de glycérol Master est utilisé alors une nouvelle transformation n'est pas nécessaire)
1) Préparer une nouvelle transformation, le cas échéant, avec le plasmide d'expression. Pour les protéines plus grandes> 100 kDa je suggère d'utiliser une récupération et la température d'incubation pendant la nuit de 30 ° C au lieu de 37 ° C, il semble créer une lignée cellulaire plus stable. La transformation globale sera inférieure donc je recommande placage deux fois plus pour assurer la formation de colonies.
2) Une fois que la transformation est terminée, la culture des stries sur des plaques LB plus les antibiotiques appropriés. Pour E. coli ce qui est généralement kanamycine ou l'ampicilline. Si vous utilisez Ampicilline je suggère substituer Carbenicillin car il est moins sensible à la dégradation de la bêta-lactamase.
Streak pour obtenir des colonies individuelles.
3) Incuber une nuit à la même température utilisée pour votre étape de récupération de transformation.
4) Préparer un ballon à chicanes de 250 ml de ce qui suit:
- 50 ml stérile Terrific Broth contenant 0,5% de glucose (poids / volume)
- Ajoutez la quantité appropriée de stock antibiotique pour obtenir une concentration finale soit 100 ug / ml
(Pour Ampicilline / carbénicilline) ou 50 ug / ml (kanamycine)
5) Ensemencer ballon avec 1-5 colonies de plaque LB
6) Incuber ballon à la même température utilisée pour la transformation.
7) Une fois que la culture est à un diamètre extérieur de 1-5 vous êtes prêt à le flacon. Pour E. coli cela prend aussi peu que 3 heures et jusqu'à dix heures, comme les souches peuvent varier considérablement dans leur temps de croissance.
8) Une fois DO finale a été atteinte Le flacon sur la glace et laisser incuber pendant dix minutes pour ralentir la croissance.
9) Pour un « navire de remise en suspension » stérile (j'utilise habituellement des tubes coniques de 50 ml stériles) ajouter 1 ml de « 30% W / V stérile Solution Glycérine » par flacon que vous souhaitez faire.
10) Dans la « 30% P / V Solution stérile de glycerol » dans la cuve de remise en suspension ajouter un volume identique de bouillon de culture résultant dans un mélange 50/50 de bouillon de solution de glycérol.
11) Mélanger en retournant plusieurs fois et récipient de placer sur la glace pour refroidir pendant 10 minutes.
12) aliquote de pré-marqué, cryo-flacons refroidis. aliquoter habituellement 1 ml par flacon 1,2 ml.
13) Placez les flacons à -80 ° C pour la congélation et de stockage.
14) Jeter le bouillon de culture restant.
15) Vous avez terminé!
Ceci est la meilleure façon d'assurer la cohérence dans vos cultures bactériennes. Les transformations peuvent sécher ou muter au fil du temps. J'ai eu le malheur d'avoir utilisé une vieille plaque de transformation ... la culture a grandi grande! Dommage qu'il n'y avait pas de protéine réelle! En collaboration avec un bon outil de gestion de laboratoire (je recommande le codage à barres), vous pouvez avoir un meilleur contrôle de l'organisation qui sera ensuite se traduire par plus de contrôle sur vos stocks archivés et, finalement, de meilleures expériences d'expression. En utilisant vos stocks de glycérol conjointement avec mes 5 conseils pour améliorer l'expression, vous serez sur votre chemin. Prendre plaisir!