Biuret dosage de protéines

vidéo spectrophotomètre

Même si vous avez déjà utilisé un spectrophotomètre visible Spectrawave, l'examen de la vidéo devrait vous aider avec le travail d'aujourd'hui, car il fournit des informations précieuses sur le dosage des protéines itseslf.

introduction

Il est évident que, pour comprendre les structures et les fonctions des enzymes, des organites, cellules, tissus, organes et systèmes d'organes, nous devons étudier les structures et les fonctions des protéines individuelles. Un point de départ à une telle étude est de savoir la quantité de protéines que nous avons. L'approche la plus commune pour déterminer la quantité de protéines que nous avons dans un échantillon est d'effectuer un essai colorimétrique pour déterminer la concentration en protéines. Dans un dosage colorimétrique d'un échantillon de protéine est mélangée avec un réactif qui change de couleur en présence de la protéine, avec une intensité de couleur proportionnelle à la concentration de la protéine dans l'échantillon.

Le dosage de la protéine biuret a été publiée en tant que méthode pour déterminer la concentration en protéines dans les années 1940, bien que la réaction elle-même a été étudié comme il y a longtemps que le début du 19ème siècle. Le test de biuret était couramment employé bien dans les années 1980 et est toujours en cours d'utilisation, car il est si commode et peu coûteux à préparer et facile à utiliser. Lorsque nous osons un échantillon de protéines que nous perdons une partie de celui-ci parce que le réactif détruit la protéine colorimétrique dans le processus. Parce que le test de biuret consomme beaucoup de protéines de nombreux laboratoires utilisent des méthodes qui utilisent un réactif de couleur beaucoup plus sensibles tels que le dosage de Bradford. Nous utilisons le test de biuret pour cette étude de laboratoire parce que vous pouvez préparer votre propre réactif à partir de réactifs inorganiques (à savoir de « zéro »), vous donnant l'occasion de mettre en pratique vos compétences en solution de prise.

Préparation

Outre l'examen et l'impression de ce protocole, s'il vous plaît examiner la ressource en ligne sur des mélanges et des solutions et le clip vidéo sur l'utilisation du spectrophotomètre WPA S1200 Spectrawave. Vous aurez également à terminer la partie A du protocole (voir ci-dessous).

Vue d'ensemble expérimental

Aujourd'hui, vous pratiquerez votre solution faire des compétences en préparant une solution complexe (réactif biuret). Nous aurons également vous apprendre à calibrer un spectrophotomètre et nous allons vous faire tester votre solution avec les normes d'étalonnage contenant de l'albumine de sérum bovin (BSA).

• Préparer le réactif de couleur biuret
• Ajouter le réactif coloré à un tube de référence et deux étalons de calibration contenant des protéines
• Calibrer un spectrophotomètre
• Lire et enregistrer des valeurs d'absorbance

*** Vous devez porter des lunettes de protection tout au long de cette session de laboratoire ***

A) Préparer le réactif de couleur biuret

Pièces 1-3 doivent être remplis avant de venir au laboratoire. Cette information fait partie de votre protocole, à enregistrer dans votre ordinateur portable que vous portez le travail.

1. Lire la formule pour le réactif biuret soigneusement et complètement. réactif biuret est constitué de 0,9% (P / V) tartrate de potassium et de sodium, 0,3% de sulfate de cuivre x 5 H2O, et 0,5% d'iodure de potassium, le tout dissous dans de l'ordre de 400 ml de NaOH 0,2 M (fw 40,0), puis amenée à un volume final d'un litre. C'est l'une de plusieurs façons dont on pourrait décrire une formule de solution.
2. L'échelle de la formule vers le bas pour faire un volume final de seulement 200 ml de réactif. Mise à l'échelle sur la formule des moyens pour régler l'ensemble des montants et des volumes pour faire un plus petit volume de solution. Par exemple, pour faire 200 ml de réactif biuret vous devez seulement 1,8 g de tartrate de potassium sodium (réduite à partir de 9 g par litre). La quantité de 1,8 g dans 200 ml est dans la même proportion que 0,9 g dans 100 ml, qui est une solution à 0,9%.
3. Notez chaque étape que vous mènerez pour préparer votre réactif, en commençant par le volume à partir de l'eau et la masse du premier réactif que vous dissoudre. Écrivez clairement chaque étape et ne rien omettre, y compris chaque fois que vous q.s. au volume. REMARQUE: Tous les produits chimiques, y compris le NaOH sont disponibles en tant que réactifs solides. Vous devrez tout préparer Fron zéro.

Pièces 4-7 de la partie A doit être achevée en laboratoire.

1. Pour utiliser un lieu de balance électronique de chargement par le dessus d'un morceau de papier peser sur le plateau. Tarer la balance par [appuyant sur le levier]. Pour peser chimique sec d'abord assurez-vous que votre spatule est propre. Sinon, puis rincer et sécher avant d'atteindre dans le pot chimique. Placez délicatement chimique sec sur le papier jusqu'à ce que vous avez la masse désirée. Si vous ajoutez trop alors ne pas retourner l'excès dans le pot. Laisse tomber dans un panier de déchets ou de le jeter dans l'évier. Nous revenons seulement un excès dans le pot si les choses est beaucoup trop cher à perdre.
2. Pour dissoudre votre produit chimique remuer l'eau ou d'une solution partiellement achevée en utilisant la barre d'agitation avec plaque d'agitation et d'ajouter le produit chimique directement à partir de la pesée du papier. Grattez si nécessaire. Si des bâtons matériels aux côtés de votre flacon puis utiliser une pipette pour laver pasteur vers le bas dans la solution.

*** Pour minimiser le risque d'éclaboussures / déversement s'il vous plaît garder le bouchon dans le ballon lors de l'agitation et de stockage ***

1. Pour q.s. le volume d'abord vous assurer que la totalité du réactif sec est dissous. Versez la solution dans un cylindre de volume approprié et puis recouvrez avec de l'eau déminéralisée. Retour la solution dans le flacon et mélanger brièvement pour mélanger.
2. Votre réactif rempli doit être bleu clair. Une fois qu'il est mélangé puis éteignez la plaque d'agitation.

B) Préparation de référence et deux standards de calibrage

Pour vérifier la qualité de votre réactif Biuret nous vous faire préparer un tube de référence avec lequel pour calibrer votre spectrophotomètre et deux étalons contenant différentes quantités de sérum-albumine bovine.

C) Préparer votre spectrophotomètre et tester votre réactif

Votre spectrophotomètres ne nécessite que très peu de temps d'échauffement.

D) Nettoyer votre verrerie et espace de travail

• Soigneusement vider les tubes de culture avec le réactif utilisé biuret dans l'évier le plus proche et les jeter dans le récipient à déchets de verre. Rincer tout réactif renversé de votre porte-peg et le retourner sur le banc avant
• Rincer les bouteilles et flacon avec de l'eau déminéralisée d'un robinet et les laisser sécher à l'air. Utilisez du savon et de l'eau et le cas échéant un goupillon pour éliminer le réactif collé à la verrerie.
• Nettoyer la surface de votre plaque d'agitation.
• Nettoyez votre spatule et rincer avec de l'eau déminéralisée.
• Brosser tout réactif déversé à partir de l'équilibre et de la surface du banc, l'élimination de celui-ci dans le plus proche poubelle.
• Rincer la pipette sérologique par l'élaboration et l'eau déminéralisée expeling quelques fois. Laissez et l'aide Pipet sur le banc - ils sont réutilisables.
• Redresser la surface de la table, laissant comme vous l'avez trouvé.

La planification du dosage des protéines

• Passez en revue la présentation Powerpoint sur des tests. également disponible sur Owlspace une copie imprimable (111_assays.pdf) avec des notes.
• Passez en revue la présentation Powerpoint sur des dilutions. également disponible sur Owlspace une copie imprimable (111_dilutions.pdf) avec des notes.

Contexte

Le dosage de biuret peut fournir une estimation quantitative de la concentration de la protéine de telle sorte que nous pourrions analyser des résultats expérimentaux ou optimiser une expérience. Rappelons que réactif biuret change de couleur avec une intensité proportionnelle à la concentration de la protéine dans un échantillon (dans certaines limites). Pour estimer la concentration en protéines dans un échantillon dont la concentration ne sait pas que nous devons utiliser des normes de comparaison. Les normes sont des échantillons contenant des quantités connues de protéines. Lorsque l'on mélange réactif coloré avec les normes que nous obtenons une gamme d'intensités de couleurs auxquelles pour comparer les inconnues.

On peut estimer la concentration en protéines d'inconnues en comparant chaque inconnue avec l'ensemble des normes, mais cette méthode présente des inconvénients évidents. Elle repose sur notre jugement et bien sûr il y a de quoi faire lorsque le changement de couleur d'un inconnu se situe entre les changements de couleur des deux normes. La dernière fois que nous vous avons présenté un dispositif appelé un spectrophotomètre. qui convertit le changement de couleur d'une quantité appelée une valeur d'absorbance. En mesurant les valeurs d'absorbance correspondant à un ensemble de normes de protéines, nous pouvons tracer une courbe standard d'absorbance par rapport à la quantité de protéines. Et Absorbance quantité de protéines sont des variables continues, nous devons donc ajouter une ligne de tendance qui se rapporte à la quantité d'absorption sur toute la plage utile du dosage.

On peut estimer la quantité de protéines dans une inconnue de son absorbance en lisant la quantité correspondante de la courbe standard. La concentration de l'inconnu est tout simplement le montant estimé divisé par le volume de l'échantillon qui a été ajouté au tube.

Préparation

Vous devrez planifier votre courbe standard à l'avance.

Vue d'ensemble expérimental

Aujourd'hui, vous allez commencer par la réalisation d'une analyse de protéines. Nous aurons vous préparez la courbe standard dans votre ordinateur portable, en classe, et l'utiliser pour estimer les concentrations de protéines pour deux inconnues. Nous disposerons alors d'utiliser les informations pour accomplir les types d'objectifs qui font partie de nombreux protocoles de laboratoire.

• Préparer un ensemble de normes de protéines, ajouter un réactif de couleur, déterminer absorbances
• Préparer inconnues pour le dosage, ajouter un réactif coloré et mesurer absorbances
• Tracer une courbe standard dans votre bloc-notes et ajouter une ligne de tendance
• Les concentrations d'estimation pour vos inconnues
• Calculer comment diluer vos inconnues en utilisant deux approches différentes
• Les rendements de la fraction d'estimation pour vos deux inconnues

*** Vous devez porter des lunettes de protection tout au long de cette session de laboratoire ***

A) Préparation des étalons protéiques

1. En se référant à la table à l'étape 3 ci-dessous, calculer le volume de 20 mg / ml de protéine de référence à entrer dans chaque tube à essai.
2. Nous voulons normaliser les volumes à 1 ml par tube avant d'ajouter un réactif de couleur. Dans le cas contraire, les volumes variables auront une incidence sur l'intensité des couleurs et fausser les résultats. Déterminer le volume d'eau à ajouter à chaque tube de sorte que le volume de départ de chaque tube est de 1 ml. Apportez ces chiffres à laboratoire avec vous
3. Sous la rubrique « normes de protéines, » mettre en place une table dans votre ordinateur portable comme dans l'exemple ci-dessous. Remplissez les deux colonnes de volume avec les valeurs que vous avez calculé avant laboratoire. Laissez la colonne vide d'absorption pour l'instant.

protéine Quantité (mg)

Volume 20 mg / ml de BSA (ml)

l'eau de volume (ml)

B) Ajouter un réactif coloré, laisser incuber, lire et enregistrer les valeurs d'absorbance

1. Lorsque vous êtes prêt, utilisez une pipette sérologique pour ajouter un réactif de couleur 5 ml à votre tube de référence et à chacun de vos normes.
2. Alors que vos tubes sont en période d'incubation au banc (10 minutes), allumer et calibrer votre spectrophotomètre que vous avez appris la dernière fois. Le tube de référence ne nécessite pas l'incubation de 10 minutes ..
3. Dans l'ordre dans lequel vous avez ajouté un réactif de couleur, lire et enregistrer l'absorbance (pas de transmission) correspondant à chacune de vos normes. Pour obtenir les meilleurs résultats de l'intervalle de temps entre l'ajout d'un réactif de couleur et d'absorbance doit être proche de la même chose pour chaque tube.
4. Gardez votre tube de référence pour vérifier à nouveau votre étalonnage lorsque vous lisez vos inconnues.

C) Préparation d'inconnues et lire les valeurs d'absorbance

Vous devrez préparer des inconnues pour la comparaison avec les normes. Bien sûr, vous devez enregistrer toutes les informations contenues dans votre ordinateur portable que vous avancez.

Nous préparons deux tubes pour chaque inconnu de sorte que si un tube contient trop ou trop peu de protéines à mesurer, l'autre tube devrait nous donner une lecture utile.

1. Pipeter le volume de dépôt de inconnue dans chaque tube respectif, suivie par le volume d'eau déposée.
2. Ajouter un réactif coloré, laisser incuber, vérifier l'étalonnage de votre spectrophotomètre et lire vos absorbances, de les enregistrer dans la colonne 4 de votre table inconnues.
3. Vérifier que au moins une lecture d'absorbance pour chacun de vos inconnues se situe dans la plage des valeurs d'absorbance de vos normes. Si vos données sont « bonnes », alors vous avez toutes les informations dont vous avez besoin pour compléter avec le reste du travail avant de partir pour la journée.

D) Nettoyer

S'il vous plaît nettoyer tous les équipements et fournitures et redresser votre zone de banc.

L'analyse des données

Préparer votre courbe standard et des concentrations de protéines estimation

Des absorbances pour vos inconnues estimer chaque concentration en protéines. Rappelons que la concentration de l'inconnu est la quantité de protéine divisée par le volume de l'échantillon utilisé, et non le volume total dans le tube à essai. Par convention, nous présentons presque toujours des concentrations de protéines en milligrammes / millilitre (mg / ml). Pour chaque inconnue me souviens aussi d'utiliser la valeur d'absorbance unique qui se situe dans la plus grande partie linéaire de la courbe standard.

Prévoyez de faire des dilutions

Afficher tous les travaux. Tout d'abord, nous aurons diluer un volume de départ spécifique à une concentration finale souhaitée de la protéine. C'est le genre de dilution que vous effectuer afin de faire une solution de travail. Deuxièmement, vous déterminerez comment préparer chacun de vos échantillons à un volume final désiré et la concentration.

1. Votre premier problème est de déterminer comment dilué 150 ul de chacune de vos deux inconnues jusqu'à une concentration finale de 1 mg / ml. Vous savez v1. vous déterminé c1 en utilisant la courbe standard, et votre concentration finale désirée de 1 mg / ml est c2. Dans votre ordinateur portable enregistrer les trois variables connues pour diluer chacun de vos inconnues. Calculer v2. montrant tous les calculs dans votre bloc-notes. Notez les deux v2 et le volume à ajouter à v1.
2. Votre deuxième problème est de déterminer la façon de diluer le chaque inconnu afin d'obtenir un volume final de 150 ul à une concentration finale de 1,5 mg / ml. Encore une fois enregistrer les trois variables connues et déterminer pour chaque inconnue la variable inconnue. Afficher tous les calculs.

Les rendements des fractions d'estimation

Une approche commune pour apprendre comment quelque chose fonctionne est de le démonter. Nous appliquons ce principe au tissu vivant lorsque nous effectuons ce que nous appelons un fractionnement de tissus. Nous commençons généralement par homogénéisant le tissu, nous séparons le broyat en composants, employant souvent une méthode appelée centrifugation différentielle. Centrifugation donne un composant solide (la pastille) qui nous remettre en suspension dans un volume de liquide. Il donne également un composant liquide, le surnageant, que nous traitons plus loin. Lorsque nous procédons à un fractionnement, nous voulons être en mesure de faire rapport la quantité de chaque élément que nous avons, en général en termes de quantité de protéine récupérée.

volumes de fraction hypothétiques

Le tableau ci-dessous présente les fractions et les volumes obtenus à partir d'un fractionnement hypothétique des tissus du foie entier. Aux fins de cet exercice, on suppose que chacun de vos deux inconnues est un échantillon de la fraction avec étiquette correspondante (par exemple inconnu A est un échantillon de la fraction A, etc.).

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