L'inhibition de la protéine carbamylation dans une solution d'urée par des tampons contenant d'ammonium

La solution d'urée est l'un des dénaturants de protéines les plus couramment utilisées pour la digestion de la protéase dans les études protéomiques. Cependant, il est reconnu depuis longtemps que la solution d'urée peut provoquer carbamylation à l'extrémité N-terminales des protéines / peptides et les groupes amino de chaîne latérale des résidus de lysine et d'arginine. Protéine / peptide blocs de carbamylation digestion de protease et affecte l'identification des protéines et la quantification dans des analyses de spectrométrie de masse en bloquant les groupes amino des peptides de marquage isotopique / isobare et la modification des états de charge de peptides, des temps de rétention et masses. De plus, carbamylation des protéines lors de la préparation de l'échantillon, il est difficile d'étudier dans carbamylation des protéines in vivo. Dans cette étude, nous avons comparé la carbamylation des peptides dans les solutions d'urée de tampons différents et constaté que les tampons contenant d'ammonium ont été les tampons plus efficaces pour inhiber la carbamylation des protéines dans une solution d'urée. Le mécanisme possible de l'inhibition de la carbamylation par des tampons contenant de l'ammonium est traitée, et une procédure révisée de la digestion par la protéase de protéines dans des tampons contenant de l'urée et d'ammonium a été développé pour faciliter son application dans la recherche protéomique.

Mots-clés: carbamylation, Urée, tampon contenant d'ammonium, Proteomics, spectrométrie de masse

INTRODUCTION

L'urée est le dénaturant le plus largement utilisé dans les études protéomiques, et il est utilisé pour augmenter l'efficacité de la protéase dans la digestion des protéines. L'urée peut également solubiliser les protéines en empêchant la précipitation des protéines et de l'agrégation [1; 2]. Cependant, la digestion des protéines dans une solution d'urée provoque la carbamylation des protéines / peptides. Bien qu'il ait été utilisé dans la quantification protéomiques [3], carbamylation présente plusieurs inconvénients pour la recherche protéomique. D'abord, il bloque la N-terminales des protéines et les groupes amino de la chaîne latérale des résidus de lysine et d'arginine dans les protéines / peptides et les empêche d'une utilisation ultérieure, telles que le couplage au support en phase solide ou le marquage iTRAQ [4; 5; 6]. D'autre part, il empêche les protéines de nombreux digestions enzymatiques, résultant en peptides incomplètement digérées. En troisième lieu, il conduit à un temps de rétention chromatographique inattendue dans la séparation de la protéine / peptide et des masses imprévues, ce qui augmente la complexité des échantillons [7]. Quatrièmement, il affecte l'identification des peptides et des protéines et une quantification précise en réduisant l'efficacité d'ionisation et l'intensité de signal des pics détectés [8]. En cinquième lieu, il affecte l'étude in vivo de carbamylation [9], qui a été reconnue comme une modification importante de protéines associées à l'urémie, des troubles rénaux et cardiovasculaires sévères [10; 11; 12]. Par conséquent, la réduction et la prévention de la carbamylation des peptides résultant de l'urée est nécessaire d'améliorer la qualité des données protéomiques quantitatives et l'analyse de la modification des protéines in vivo par carbamylation.

Dans cet article, nous présentons l'utilisation de tampons contenant de l'ammonium pour inhiber la carbamylation de protéine / peptide dans une solution d'urée. Le bicarbonate d'ammonium (NH4 HCO3) et deux autres tampons contenant de l'ammonium ont montré une meilleure efficacité d'inhibition de la carbamylation de tampon phosphate (PB) et du tampon Tris-HCl. Une forte concentration de tampon NH4 HCO3 (1M) a inhibé presque toute la carbamylation des protéines / peptides de sérum humain sans effet sur la digestion par la trypsine. Plus important encore, la solution est HCO3 NH4 un tampon couramment utilisé dans de nombreux protocoles de digestion enzymatique et est donc très applicable pour la recherche protéomique.

matériaux et méthodes

Produits chimiques et réactifs

peptides standard de l'angiotensine et la neurotensine, la fétuine protéine standard bovine, le sérum humain (liquide congelé), le tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP), l'iodoacétamide, le bicarbonate d'ammonium, acétate d'ammonium, des tampons de bicarbonate de triéthylammonium et de tampon Tris-HCl (pH 7,6) étaient acheté auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri,). urée séquençage de qualité, l'acétonitrile LC-MS qualité (ACN), l'acide trifluoroacétique (TFA) et de l'acide formique (FA) ont été achetés chez Thermo Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). a été acheté chez Promega Corp. trypsine modifiée séquençage qualité (Madison, WI). Le kit standard de peptide pour MALDI-TOF-MS a été acheté chez AB SCIEX (Framingham, MA). colonnes Sep-Pak C18 (1cc) ont été obtenus à partir des eaux (Milford, MA). C18 zip-conseils ont été achetés auprès de Millipore (Bedford, MA). matrice d'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA) a été acheté chez Agilent (Palo Alto, CA).

Carbamylation des peptides standards sur

Carbamylation sur une protéine standard

fétuine bovine (40 # X000b5; g) a été dénaturé et mis en incubation à 20 # X000b5; urée 8M L dans l'un des tampons suivants: 0,1 M PB, pH8; 0,2 M Tris-HCl, pH 7,6; 0,2M NH4 HCO3; et 1 M de NH4 HCO3 à la température ambiante pendant 30 min. La protéine a été réduit avec 10 mM de TCEP à 37 # x000b0; C pendant 1 h et alkylé en utilisant 15 mM d'iodoacétamide à la température ambiante pendant 30 min dans l'obscurité. Les échantillons ont été dilués 5 fois avec des tampons respectifs, comme mentionné ci-dessus (concentration finale de l'urée était 1,6M) et ont été digérés par la trypsine (protéine: enzyme, 50: 1, en poids / poids) à 37 # X000b0; C pendant 18 h. Ensuite, 10% de chaque échantillon a été dessalée par C18 zip pointe avant l'analyse MALDI-TOF-MS.

Carbamylation sur sérum humain

Deux microlitres de sérum humain (Sigma) a été dilué 10 fois avec de l'urée 8M dans l'un des tampons suivants: PB, pH8; Tris-HCl 0,2 M; 0,2M NH4 HCO3; et 1 M HCO3 NH4. Après avoir été réduite et alkylée comme indiqué ci-dessus, les échantillons ont été dilués 5 fois avec chacun des tampons suivie par une digestion avec de la trypsine (protéine: enzyme, 50: 1, en poids / poids) à 37 # x000b0; C pendant 18 h. Les échantillons ont été dessalés en utilisant des colonnes de C18 de 1cc et séchées dans un SpeedVac. Les peptides séchés ont été remises en suspension dans 0,1% de TFA pour l'analyse LC-MS / MS.

MALDI-TOF-MS et l'analyse LC-MS / MS

Pour l'analyse MS, les peptides obtenus ci-dessus ont été analysés par MALDI-TOF-MS (Applied Biosystems 4800). Les spectres ont été acquis dans le mode réflecteur. Le rapport de carbamylation relative en utilisant l'aire de pic du peptide carbamylée divisé par l'aire du pic de peptides non-carbamylées a été utilisé pour la quantification des peptides carbamylées. Pour l'analyse LC-MS / MS, 1 # x000b5; g de peptides trypsiques générés à partir de sérum humain a été analysée par un spectromètre de masse LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific). Les peptides ont été séparés sur un système Dionex ultime 3000 RSLCnano (Thermo Scientific) constitué d'un 75 # X003bc; m # X000d7; 15 cm Acclaim PepMap100 colonne de séparation (Thermo Scientific) en aval d'une colonne de garde de 2 cm (Thermo Scientific). Le débit de la phase mobile a été réglé à 300 nL / min et était composé de 0,1% d'acide formique dans de l'eau (A) et 0,1% d'acide formique dans 95% d'acétonitrile (B). Le profil de gradient a été établi comme suit: 4-35% de B pendant 70 min, 35-95% de B pendant 5 min, 95% de B pendant 10 min et équilibrage à 4% de B pendant 15 min. l'analyse MS a été réalisée à l'aide d'un spectromètre de masse Pro Orbitrap Velos (Thermo Scientific). La tension de pulvérisation a été fixée à 2,2 kV. Orbitrap spectres MS1 (AGC 1 # x000d7; 10 6) ont été acquis 400-1800 m / z à une résolution de 60K suivie par HCD MS / MS dépendant de données (résolution 7500, collision énergie de 45%, le temps d'activation de 0,1 ms) de les dix ions les plus abondants en utilisant une largeur d'isolement de 2,0 Da. Charge criblage d'état a été activé pour rejeter des ions non affectés et à charge unique. Un temps d'exclusion dynamique de 35 secondes a été utilisé pour établir une discrimination contre des ions sélectionnés.

Recherche de base de données

résultats et discussion

Carbamylation des peptides dans différents tampons avec de l'urée

peptides standard utilisés pour le dosage de la carbamylation des peptides et les masses de peptides de leur forme non modifiée et carbamylée.

Pour déterminer le degré de carbamylation du groupe amino N-terminal et un groupe amino de la lysine dans de l'urée avec des tampons différents, nous avons calculé le rapport de carbamylation relative en utilisant la surface du pic du peptide carbamylée divisé par l'aire du pic de peptides non-carbamylée. Le rapport relatif de carbamylation ne reflète pas le pour cent de carbamylation d'un peptide spécifique puisque l'efficacité d'ionisation des carbamylées et des formes non-carbamylée du même peptide sont différents. Cependant, le rapport de carbamylation rapport fournit un moyen commode pour mesurer le degré de carbamylation du même peptide dans des conditions différentes. Les rapports de carbamylation relatifs des deux peptides dans différents tampons sont représentés sur la figure 1. Pour l'angiotensine, qui contient un groupe amino à son extrémité N-terminale, le rapport relatif de carbamylation est de 0,20 et 0,31 dans le tampon PB et 0,2 M de tampon Tris-HCl, respectivement, tandis que le rapport de carbamylation a été considérablement réduite par rapport à 0,036 à 0,2 M tampon NH4 HCO3 (Fig. 1A et 1C). Pour la neurotensine, qui ne contient pas un groupe amino à son extrémité N-terminale, la carbamylation se produit principalement au niveau des résidus de lysine avec des rapports de carbamylation relatives de 0,049 et 0,047 dans du tampon PB 0,2 M et du tampon Tris-HCl, respectivement. Le rapport de carbamylation relative est réduite à 0,026 à 0,2 M tampon NH4 HCO3 (Fig. 1B et 1C). La tendance générale était que carbamylation plus souvent eu lieu au # X003b2; -amino groupes de peptide / protéine N-terminale qu'à la # X003b2; -amino groupes de chaînes latérales de la lysine, ce qui est cohérent avec des rapports antérieurs [9; 16]. Le tampon fourni la HCO3 NH4 protection le plus élevé contre les peptides carbamylation parmi tous les tampons que nous avons testé.

L'inhibition de la carbamylation des peptides par différents tampons. Angiotensin et la neurotensine ont été incubées à 37 # x000b0; C pendant 18 h dans différents tampons (0,1 M PB, 0,2 M de Tris-HCl et 0,2 M de NH4 HCO3) avec une solution 1,6 M d'urée. A) carbamylation de peptide angiotensine.

L'effet de la température et de la concentration de l'urée sur l'inhibition de la carbamylation par NH4 HCO3 solution a également été étudiée. Les résultats ont indiqué que, bien que le tampon NH4 HCO3 a montré une protection efficace de peptides par rapport à un tampon PB même à 95 # x000b0; C en 1 heure, le taux de carbamylation relatif considérablement augmenté par rapport à une température plus basse (Tableau S1). Par exemple, 1 M HCO3 pourrait encore NH4 empêcher presque complètement toute carbamylation de peptide N-terminal avec incubation à 60 # x000b0; C pendant 1 h. Cependant, le rapport de carbamylation relative de l'angiotensine et la neurotensine a atteint 12,2 et 3,7 à 95 # x000b0; C en 1 heure, respectivement. La concentration d'urée est un autre facteur très important qui a touché le niveau de carbamylation du peptide. Les données ont montré une tendance générale selon laquelle la carbamylation des peptides pourrait continuer à augmenter avec l'augmentation des concentrations d'urée, même en présence de 0,2 M de tampon NH4 HCO3 (Fig. S1). Compte tenu de tous les facteurs énumérés ci-dessus, il a été conclu que la carbamylation aux deux extrémités N-terminales et les chaînes latérales de lysine de peptides pourrait être évitée dans 1 M NH4 tampon de HCO3 avec 1,6M solution d'urée à 37 # x000b0; C pendant aussi longtemps que 18 heures.

Carbamylation lors de la digestion des protéines dans une solution d'urée

Pour étudier l'effet de différents tampons sur la digestion des protéines, une protéine standard fétuine bovine a été choisie pour la digestion trypsine et la mesure de carbamylation. Fétuine a été dénaturé (température ambiante pendant 30 min), réduite (37 # x000b0; C pendant 1 h) et (la température ambiante pendant 30 min) alkylée dans 0,1 M de PB, pH8; 0,2 M Tris-HCl, pH 7,6; 0,2M NH4 HCO3 ou NH4 1M tampon de HCO3 avec 8 M d'urée suivi par une dilution de 5 fois avec le tampon correspondant (la concentration finale en urée était 1,6M et la concentration du tampon est demeurée inchangée) et de la trypsine a été ajoutée pour la digestion à 37 # X000b0; C pendant 18 heures. Les résultats ont montré que 16 des 21 peptides tryptiques théoriques (masses peptidiques entre 500 et 5000 Da) ont été détectés à partir de la digestion dans toutes les mémoires tampon par MALDI-TOF-MS (tableau S2). Les peptides non détectés peuvent contenir des glycosylation (2 peptides) ou d'autres modifications inconnues (3 peptides). En outre, les profils et l'intensité des spectres MALDI-TOF-MS entre les échantillons dans différents tampons étaient très similaires (données non présentées). Ces données indiquent que la concentration élevée de tampon de HCO3 NH4 (1M) n'a pas affecté la digestion de la trypsine de fétuine.

Pour mieux évaluer l'effet protecteur du tampon NH4 HCO3 sur la carbamylation des peptides pendant la digestion des protéines, six peptides à partir de la fétuine ont été sélectionnés pour une analyse supplémentaire tryptiques pour déterminer le rapport de carbamylation relative dans différents tampons à base de carbamylation N-terminal, la carbamylation de la lysine de peptides après digestion trypsique et la lysine carbamylation au niveau de la protéine provoquant un clivage manqué de peptides tryptiques à la lysine carbamylée (tableau 2). Deux des peptides tryptiques contiennent des groupes amino interne N-terminale et les résidus d'arginine à leur extrémité C-terminale (peptide n ° 1 et n ° 2 du tableau 2), deux autres contiennent des groupes amino interne N-terminale et les résidus lysine à leur extrémité C-terminale ( peptide N ° 3 et n ° 4 dans le tableau 2), tandis que les deux autres contiennent des résidus de lysine carbamylées au niveau des résidus de lysine clivés manqués, les groupes internes amino N-terminal, et les résidus d'arginine à l'extrémité C-terminales des peptides trypsiques (peptide n ° 5 et N ° 6 dans le tableau 2). Les rapports de carbamylation par rapport à l'extrémité N-terminale du peptide # 1 et # 2 sont 0,098 et 0,082 dans PB, 0,11 et 0,089 à 0,2 M, tampon Tris-HCl, 0,016 et 0,012 à 0,2M NH4 HCO3. et pas carbamylation dans 1M HCO3 NH4. respectivement (Fig. 2). Cependant, les rapports totaux de carbamylation de la double carbamylation des peptides trypsiques contenant les deux résidus de lysine à leur extrémité C-terminale et les groupes amino N-terminal interne (peptide N ° 3 et n ° 4) ont été de 0,10 et de 0,089 à PB, 0,12 et 0,095 à 0,2 M, Tris -HCl tampon, 0,021 et 0,013 à 0,2 M tampon NH4 HCO3, et 0,003 et 0 dans du tampon 1 M NH4 HCO3, respectivement (Fig. 2). Ces données indiquent que la carbamylation au niveau des deux résidus N-terminaux et de lysine de peptides peut être efficacement inhibée dans un tampon 1 M NH4 HCO3. Les deux peptides sélectionnés avec les lysines clivés manqués internes ne sont pas détectés par MALDI-TOF-MS, ce qui suggère que la carbamylation qui se produit au niveau de la protéine au cours de la dénaturation, de procédés de réduction et d'alkylation était négligeable, et la digestion par la trypsine a été aussi complète dans tous les quatre tampons. Les résultats ont montré que le tampon NH4 HCO3 fourni la meilleure protection contre la carbamylation des deux protéines et peptides niveaux, et 1 M de NH4 HCO3 protéine presque complètement inhibée et la carbamylation peptide.

carbamylation relative par digestion de la protéine dans différents tampons avec de l'urée. fétuine bovine a été dénaturé, réduit, alkylé et digéré dans différents tampons (PB 0,1 M, 0,2 M Tris-HCl, 0,2 M et 1 M NH4 HCO3 NH4 HCO3) avec une solution d'urée.