Cdc42 protéines (TPS Tagged) - cytosquelette, Inc
Usages du produit Inclure
- des études de liaison Cdc42 du FEM
- L'inhibition de Cdc42 GEFs in vitro
- L'inhibition de Cdc42 in vivo par microinjection
Matériel
La forme dominante négative de la protéine Cdc42 (isoforme G25K) contient une threonine à la substitution de l'asparagine au niveau du résidu 17. Le nom commun pour ce mutant Cdc42 est (T17N) (ou N17Cdc42). La substitution de l'asparagine l'affinité abolit la protéine pour GTP et réduit son affinité pour le PIB. Par conséquent, le Cdc42 (T17N) est toujours soit dans un état libre de nucletiode ou dans son inactif, lié au PIB, l'État. À cause de cela, il se lie fortement à Cdc42 GEFs et il bloque le type sauvage Cdc42 d'être activé par ces GEFs.
forme dominante négative de la protéine Cdc42 humaine a été exprimée dans un système bactérien, et est disponible sous forme d'une protéine de fusion étiquetée GST. La protéine recombinante est de 50 kDa composée de la protéine Cdc42 (22 kDa) et une étiquette 28 kDa TPS. La balise est à l'extrémité amino de la protéine. La protéine est fourni sous forme d'une poudre lyophilisée. Lorsqu'il est reconstitué dans de l'eau distillée à 1 mg / ml, la protéine se trouve dans le tampon suivant: Tris 2 mM pH 7,6, 0,5 mM de MgCl2. 0,5% de saccharose, 0,1% de dextran. La concentration en protéine est déterminée par la précision avancée rouge de dosage de protéine réactif (Cat # ADV02).
Pour les autres formes de Cdc42, ainsi que beaucoup d'autres petits purifiés protéines G, notre principale petite voir la protéine G page du produit.
Pureté
La pureté est déterminée par densitométrie à balayage de protéines sur des gels de SDS-PAGE. Les échantillons sont> 90% de pureté, le principal contaminant fonctionnant à 28 kDa est une protéine TPS.
Figure 1: GST-Cdc42 détermination de la pureté (T17N). 10 pg de C17G01 a été exécuté sur un gel SDS-PAGE et colorées avec du bleu de Coomassie
Activité biologique
L'activité de Cdc42 (T17N) a été vérifiée par la capacité de la protéine à inhiber l'activation FEM de type sauvage Cdc42 dans un essai in vitro FEM (Cat # BK100).
Question 1: Après la protéine lyophilisée reconstituant à l'eau, quelle est la composition du tampon la protéine Cdc42 humaine dominant négatif est en?
Réponse 1: La protéine doit être reconstitué à 1 mg / ml par addition de 25 ul d'eau distillée. La protéine sera alors dans le tampon suivant: Tris 10 mM pH 7,5, 10 mM de NaCl, 0,3 mM de MgCl2. 1,0% de saccharose et 0,2% de dextrane. Afin de maintenir l'activité biologique élevée de la protéine, il est fortement recommandé que la solution de protéine est complétée avec du DTT à 1 mM de concentration finale
Question 2: Quelle est la méthode recommandée pour stocker la protéine Cdc42 de type sauvage pour maintenir une activité élevée?
Réponse 2: Afin de maintenir l'activité biologique élevée de la protéine, il est fortement recommandé que la solution de protéine est complétée avec du DTT à 1 mM de concentration finale, aliquotés en expérimentation de taille montants, une congélation instantanée dans de l'azote liquide et stockés à -70 ° C C. La protéine est stable pendant 6 mois si elle est stockée à -70 ° C. La protéine ne doit pas être exposé à des cycles de gel-dégel répétés. La protéine lyophilisée est stable pendant 1 an si stocké desséchées à <10% humidity at 4°C.
Question 3: Quelle est la mutation que la protéine Cdc42 a qui le rend dominant négatif?
Réponse 3: Cette protéine possède une threonine à la substitution de l'asparagine à l'acide aminé 17.