Comment rendre compétentes E
Une méthode Hasty pour préparer E. coli compétentes
PROCÉDURES
Contour; croître E. coli jusqu'à environ 0,4 unité D.E. 600 à température ambiante et remplacer le milieu avec un tampon de transformation (TB).
1. Jour 1, le matin. Autoclaves (A / C) et marchandises sèches en laboratoire suivant. Lorsque vous êtes hâtive. les sécher (prendre les couvercles) dans une chambre à air propre sous ventilation après A / C.
Un ou deux tubes de 165 mm de verre avec bouchon en polypropylène (ou jetable sterlie tube de 15 ml Falcon)
Deux flacons de verre triangulaires avec couvercle en feuille d'Alminium (une réserve)
Dix à douze microtubes de 2 ml (utiliser des tubes de tolérance pour le stockage dans l'azote liquide)
Conseils jaune et bleu
Préparer SOB. médias SOC et la tuberculose aussi, si vous avez pas de stock d'entre eux dans un réfrigérateur.
2. DAY1 fin d'après-midi. Répartir environ 2 ml SOB à l'un des tubes de verre A / C'ed et 50mL les deux flacons. Inoculer la souche appropriée de E. coli dans un bouillon de glycérol en SOB dans le tube de verre en prenant 1-2uL du stock avec une pointe jaune. SOB de magasin dans les flacons dans un réfrigérateur jusqu'à utilisation lendemain. Conserver strictement stérile.
3. Agiter pendant une nuit à croître E. coli à 37 ° C dans un agitateur à bain d'eau. Il deviendra assez turbides le lendemain matin.
4. Jour 2, matin. Ensemencer environ 0.5-2mL de la culture de E. coli dans l'un des SOB dans un ballon. A ce moment, le milieu devient déjà légèrement turbide. Secouer à température ambiante de croître. Le reste de E. coli dans SOB peut être stocké sous forme de stock de glycérol pour une utilisation ultérieure.
6. glace refroidir la culture bacteral dans un flacon pour 5 min-1 heure. A ce stade, et plus tard, garder solution contenant E. coli froid glace avec soin pour rendre les cellules compétentes très efficaces. Gérer la solution dans une chambre à air propre. Transférer la culture dans un tube stérile 50mL Falcon. Centrifugeuse à 1000-3000 pour xG 10-5min à 4 ° C.
7. Pendant le temps de centrifugation, mettre les 2 ml microtubes sur un tubestand et les mettre en attente dans un congélateur pour refroidir. Ne pas trop cool.
9. Centrifugeuse et jeter le surnageant comme ci-dessus. Ajouter 5 ml de la TB. Remettre en suspension le culot.
10. Ajouter 350uL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et mélanger doucement tout de suite. Le mélange DMSO avec de l'eau fait la chaleur et garder la solution bactérienne dans un seau à glace. Les cellules bactériennes deviennent compétentes.
11. rapidement mais aliquote doucement la solution de cellules compétentes dispencing chacun des 500 ul microtubes 2 ml sur le tubestand refroidis. Veillez à ne pas réchauffer la solution cellulaire.
12. Stocker la cellule compétente dans de l'azote liquide ou dans un congélateur à -80 ° C. L'azote liquide stocké cellule compétente est bon pour environ un an sans perte de compétence dans un sens pratique.
TRANSFORMATION
Grandes lignes: mélanger la solution de cellules compétentes avec le plasmide, garder sur la glace pendant 30 minutes, donner un choc thermique, et plus-croître pendant 1 heure.
1. Pour commencer les procédures conveniency de transformation autour de 15 heures Décongeler cellule compétente lentement sur la glace. Ne pas secouer et plus chaud. Mettez de côté la solution cellulaire fondue sur la glace.
2. Dispence à mettre une goutte de solution de plasmide ou d'un mélange de réaction de ligature sur le fond d'un tube Eppendorf de 2 ml. Conserver strictement stérile. Placer le tube sur la glace pour refroidir.
3. Versez 100 ul de solution de cellules compétentes décongelées doucement sur le plasmide refroidi de glace ou d'une solution de mélange de ligature. Des solutions sont naturellement mélangées. Ne pas mélanger vigoureusement.
4. Gardez le tube sur la glace pendant 25 minutes.
5. Faire de l'eau chaude à 43-44C bouillante faiblement ou avec geyser. Il faut environ 5 minutes pour faire chaud l'eau (25 + 5 = 30 min.).
6. Placer le tube dans l'eau chaude sur un flotteur tubulaire pour 45-50sec.
7. Réfrigérer le tube sur la glace. Procéder immédiatement à l'étape suivante. Un manuel de laboratoire dit de le garder pour 1-2min. sur la glace, mais il faut environ une minute pour se préparer à l'étape suivante.
8. Ajouter 1 ml de SOC et le secouer pour 40-60min à 37 ° C. Un manuel de laboratoire dit qu'il préchauffer à 37 ° C, mais il est tout aussi efficace de verser SOC juste le sortir d'un réfrigérateur.
9. agitation. propager quantité appropriée de X-gal et IPTG (C.A. 20 10uL + 20-50uL d'eau milli-Q) sur une ou deux LB Amp + de plaque de gélose selon la combinaison de la souche hôte et le plasmide vecteur. Laisser sécher pendant un certain temps avec le couvercle ouvert à moitié dans une chambre à air propre.
10. Étaler 100 ul de SOC ajouté et la solution de cellule transformante recouvert sur la plaque de gélose. Si l'on attend l'efficacité de la réaction de ligature faible, le reste jeter dans de la solution à 15 000 xG pour concentrer les cellules environ 10 fois. Jeter le plus du milieu. Les cellules dans Resuspendre le reste du milieu, et l'étaler sur une autre plaque de gélose. Sinon pour le coffre-fort, il est conseillé de régler le reste du côté transformante dans un réfrigérateur jusqu'au lendemain. Si le nombre de colonies transformantes étaient trop petites, vous pouvez l'étaler sur une autre plaque de gélose cellules de concentration de la même manière que ci-dessus.
11. enrouler autour du couvercle de la plaque avec du parafilm. Incuber à l'envers du jour au lendemain à 37 ° C. Gardez la plaque dans un réfrigérateur si les colonies bactériennes apparaissent dans le lendemain matin.
Over-croissance
Mettez des tubes sur un dispositif de rotation, mettre le dispositif de rotation dans un incubateur sec fixé à 37 ° C, et tourner les tubes. Utilisez un grand incubateur, ou il deviendra trop chaud pour la production de chaleur à partir du rotateur. S'il n'y a pas grand incubateur ni rotateurs, il est correct d'utiliser le shaker bain d'eau avec un tube de 50 ml Falcon préchauffé dans lequel vous pouvez mettre des tubes de 2 ml avec du papier de soie d'emballage. Immerger le tube Falcon sur le côté à trembler.
Calcul des compétences
Lorsque 100 colonies sont apparues sur une plaque de gélose de propagation de la solution transformante 100 ul, qui est faite de la solution de cellules compétentes et 100 ul 1UL de solution de plasmide 10 pg / uL à 10 fois par dilution SOC, le conpetency serait
10 5 + 2 + 1 = 10 8 cfu / ug de plasmide. 100 ul solution de cellules compétentes. (10 pg x 10 5 = 1 ug, 100 = 10 2. 10 1 fois dilué)
PRODUITS CHIMIQUES ET SOLUTIONS
SOB Medium
Pour 200 ml (mélanger le bouillon suivant et une solution de Mg à 100: 1 dans un environnement stérile, stable pendant environ un an sous réfrigération);
Bouillon
Bacto-tripton 4 g
extrait de levure 1 g
0,4 ml de NaCl 5 M
KCI 3M 0.167mL
200 ml d'eau
A / C
SOC Medium
Mélanger milieu SOB et la solution de glucose à 100 ci-après: 1 dans un environnement stérile. Stable pendant un an sur les sous réfrigération.
3.603g de glucose
Ajouter de l'eau milli-Q jusqu'à 10 ml.
A / C
TB
Pour 200 ml;
TUYAUX 0,6g
CaCl2. 2H2 O 0,44 g
KCI 3M 16.63mL
Ajouter environ 170 ml d'eau milli-Q.
Ajuster le pH à 6,7 avec une solution de KOH.
Ajouter;
MnCl2. 4H2 O 2,18 g
Régler le volume à 200 ml avec de l'eau milli-Q.
Stérilisez à travers le filtre de 0.2um.
Stable pendant plus d'un an sous réfrigération. Gardez-stérile.
LB Amp + plaque de gélose
Pour 20-30 plaques;
Bacto-tryptone 3g
extrait de levure 1,5g
NaCl 5 M 5.134mL
agar 4.5g
300 ml d'eau
A / C
Utilisez une bouilloire Alminium pour plus de commodité.
A ce stade, et plus tard, la poignée quoi que ce soit stérile dans une chambre à air propre jusqu'à ce que des plaques d'agar sont couverts et enveloppés.
Refroidissez le milieu LB agar à 60-70C, ajouter 300uL solution Amp. et mélanger.
Verser 10-15 ml du milieu dans une plaque en matière plastique jetable, et agiter doucement à se répandre sur le fond de la plaque. Couvrir et empiler.
Verser, agiter, couvrir et empiler une après l'autre, des impulsions avec une flamme afin d'éviter un caillot.
Après la formation de caillots de gélose, ouvrir le couvercle de la plaque à mi-chemin sous ventilation d'une chambre à air propre pour sécher la gélose pour 30-60min. Ne pas trop sec.
Après vapeur à l'intérieur du couvercle a disparu, fermez le couvercle, pile, emballage et stocker à l'envers dans un réfrigérateur.
Bon pour un ou deux mois sous réfrigération. Les plaques de plus de deux mois peuvent être utilisés avec environ 3-5uL Amp étalé avec X-gal et IPTG.
NaCl 5 M (pour 1000 ml)
292.5g NaCl
Ajouter de l'eau milli-Q jusqu'à 1000 ml.
A / C
Stable pendant des années sous réfrigération.
KCl 3M (pour 100 ml)
KCI 22.365g
Ajouter de l'eau milli-Q jusqu'à 100 ml.
A / C
Stable pendant des années sous réfrigération.
Solution Amp
Ampicilin sel de sodium 500 mg
50% d'éthanol 10 ml
Stable pendant des années dans un congélateur. Manipulation stérile est inutile.
Kanamicine, tetracycline
Soit kanamicine ou 500mg tétracycline
eau Milli-Q 10mL
Stériliser à travers un filtre de 0,2 pm. Aliquat et stocker dans un congélateur. Stable pendant des années. Éviter les cycles de gel-dégel répétés.
X-gal
X-gal 100mg
diméthylformamide 5ml
Stable pendant environ un an dans un congélateur. Plus SOTRAGE rend la solution un peu de couleur, mais il fonctionne toujours très bien.
IPTG
IPTG 119 mg
eau Milli-Q 5mL
Aliquote et stocker dans un congélateur. Bon pour les années.