Cellules compétentes - Stocks de démarrage Glycérine

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Ce protocole est pour les scientifiques qui doivent faire des cellules compétentes plusieurs fois par an. Les stocks de glycérol vous permettra de commencer avec peu de préparation.

Préparer d'abord:
  • 500 ml de milieu LB (10 g de NaCl, 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure dans l'eau 1 L)
  • 25 ml de solution de glycérol (65% de glycerol, 0,1 M MgSO4, 0,025 M pH Tris / HCl 8)
  • 1x 1 L flacon Erlenmeyer autoclavé / stérile
  • flacons 3x 10-50 ml de autoclavés / stérile
  • des plaques d'agar sans antibiotiques (1 L de LB + 16 g de gélose)
  • 2x tubes à centrifuger de 250 ml de rotor Beckam J14 autoclavés / stérile
  • Au moins 50 tubes Eppendorf autoclave / stérile
  • Requis: Centrifugeuse Beckam avec rotor J14 ou similaire

  1. bactéries étalé sur une plaque LB sans antibiotiques
  2. Incuber pendant une nuit à 37 ° C.
  3. Le matin, prendre trois fois une colonie unique et inoculer 3 ml LB
  4. Incuber à 37 ° C en secouant (200 rpm)
  5. Le soir, inoculer 250 ml de milieu LB dans un Erlenmeyer de 1 litre avec l'une des cultures
  6. Incuber à 37 ° C sous agitation (200 rpm) pendant la nuit
  7. Dans la matinée, centrifuger à 4000 rpm pendant 10 min à 4 ° C
  8. Remettre en suspension dans 25 ml de LB froid
  9. Ajouter 25 ml de solution de glycérol et bien mélanger
  10. Magasin à aliquotes de 1 ml à -80 ° C

1. bactéries étalé sur une plaque LB sans antibiotiques

Faire trois grèves de dilution et le travail très stérile. Nous devons choisir des colonies isolées dans l'étape suivante.

2. incuber pendant une nuit à 37 ° C.

3. Le matin ramasser trois fois une colonie unique et inoculer 3 ml de LB

Il est important d'obtenir Elégante grandes colonies (à croissance rapide). Ce sera le produit de départ de tous vos stocks, si les colonies sont maintenant pas les choses parfaitement saines sur la route sera difficile pour longtemps. Ici, nous utilisons les flacons 10-50 ml stériles.

4. Incuber à 37 ° C en secouant (200 rpm)

5. Le soir inoculer 250 ml de milieu LB dans un Erlenmeyer de 1 litre avec l'une des cultures

Utilisez une croissance la plus rapide des trois. Nous avons préparé trois cultures pour être en mesure de choisir maintenant.

6. Incuber à 37 ° C sous agitation (200 rpm) pendant la nuit

7. Dans la matinée, centrifuger à 4000 rpm pendant 10 min à 4 ° C

8. Remettre en suspension dans 25 ml de LB froid

9. Ajouter 25 ml de solution de glycérol et bien mélanger

10. Stocker dans des aliquotes de 1 ml à -80 ° C

Ceci est maintenant un stock de glycérol concentré prêt à l'emploi. Il vous permet de inoculer des cultures avec des quantités égales, ce qui permet de prédire le temps jusqu'à ce qu'ils atteignent un certain diamètre extérieur.

Problèmes connus:

  • Travailler très stérile! Nous ne pouvons pas utiliser des antibiotiques dans les bactéries compétentes et toute contamination se propagera à l'étape suivante. Vous ne faire qu'une seule fois depuis longtemps, prenez votre temps et de travailler aussi bien que possible!

J'ai commencé à faire des cellules compétentes de cette façon quand je devais faire des cellules compétentes pour le laboratoire entier. Il a vraiment sauvé un certain temps.

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