L'utilisation de sérum-albumine bovine comme agent de blocage
Western Blot avec BSA comme agent de blocage
10x Phosphate Buffered Saline.PBS (pour éliminer le methanol à partir de blots)
NaCl 80 g (1,37 M pour 10x)
KCl 2g (27mm pour 10x)
Na2 HPO4 (80 mM de 10x)
KH2 PO4 (20 mM de 10x)
eau 1L
pH à 7,4 avec HCl
PBS Tween.PBST (pour les blots de lavage)
PBS 2L
Tween-20 (bouteille Brown) + 1 ml en pipettant dans pipeteur avec ou ampoule en plastique
remuer une demi-heure
buvard
1. Mouillez un sèche, blot transféré avec du méthanol si la tache est faite avec PVDF, ou faire tremper dans du PBS si blot est fabriqué à partir de nitrocellulose (notez que le méthanol est toxique, donc porter des gants et Don.t inhaler) POUR DON NITROCELLULOSE blots. T WET AVEC METHANOL OU AUTRE IT.LL DISTINTEGRATE DANS VOS MAINS
2. Rincer
5x PBST 5-10 minutes chacun
(Notez que la peroxydase de raifort est une enzyme et donc sensible à la température, il est donc préférable de le laisser à 4 degrés si vous ne pouvez pas continuer immédiatement à développer, mais essayez de ne pas le laisser à 4 degrés trop longtemps [1-2 heures est probablement OK])
Affichage de la tache
1. Mélanger des quantités égales de solution A - B (ECL
1,5 ml chacun de A - B)
2. roche manuellement pendant 1 min.
3. Enrouler autour de Saran Wrap blots
4. enlever des gants lorsque le film de manipulation
5. éteindre toutes les lumières (peut laisser une faible lumière rouge sur) lorsque le film retrait de la boîte et placez film restant en arrière dans la boîte avant de traiter la pièce nouvellement retirée du cinéma
6. film place sur le dessus de la tache dans la cassette de film, faire une note de l'orientation du film
7. exposer pour 15sec -2 minutes et, si nécessaire, utiliser un autre film et exposer pour anthère 20 min.
8. développer la tache
Avec BSA Immunofluorescence comme agent de blocage
5x tampon PB (= 250 mM de tampon phosphate, pH 7,2 après dilution)
Pour 500mL,
Mélanger 140 ml 0,25 M P04 NAH2
+ 360 ml 0,25M NAH2 P04
OU
1x PB, 500mL
35 ml 0,2M NAH2 P04
90 ml 0,2M NAH2 P04
375ml d'eau
1x PB est nécessaire pour les procédures ci-dessous
20% de Triton
. Peser Triton sur un 2g équilibre par pipetage dans un tube,
. Faire jusqu'à 10 ml avec de l'eau distillée
. roche nuit
4% de paraformaldehyde (STIR IN hotte)
Pour 50 ml,
. utilisation
40 ml d'eau pour dissoudre 2 g paraformaidehyde
. ajouter 200ul 0,2N et la chaleur NAOH, tout en agitant dans la hotte
. Une fois dissous, + 10 ml de tampon 5x PB
. geler en
aliquotes dans le 10-15ml .20 congélateur
Normale de chèvre Serum.NGS
. magasin en aliquots dans le congélateur
Remarques:
. si après fixation des cellules, les laisser humide au réfrigérateur, couvert du PB du lavage
. soyez prudent lorsque pipetage et la suppression des solutions; sinon, les cellules se détacheront
ELISA avec BSA comme agent de blocage
des plaques de microtitration Nunc (moyen de liaison) PolySorp F96 475094 (plaques RIA)
Maxisorp F96 442404
ABTS (disponible chez Sigma, par exemple)
tampon A
Disodium hydrogène orthophosphate 1 M (20 ml d'eau)
Acide citrique 1 M (16 ml d'eau)
Mélanger et diluer à 164 ml, pH à 4,0
Conserver dans l'obscurité à la température ambiante
Faites des échantillons en triple exemplaire
+60 ul de chaque solution à la même à chaque fois; lavage / rinçage sont appliqués pour remplir le puits et enlevés en inversant la plaque et jeter l'excès de solution
Notez que toutes les protéines (y compris BSA) utilisent PBS 1x comme diluant
Les variations comprennent l'application de certaines protéines en utilisant une dilution en série ou 10x
Peut utiliser Pipet multi-canaux pour accélérer la livraison de solutions aux plaques de microtitration
- Plate Protein 1 pendant une nuit à 37 ° dans un incubateur (couvrir avec une zone de pointe de la pipette 1 ml) - protéine diluer à 1 à 100 ug / mL
- Rincer avec du PBS
- Bloc avec 4% de BSA dans du PBS, à 1 heure
- Rincer avec du PBS
- Ajouter 2 protéines + 0,1% de BSA
- Incuber 1-4 heures à la température ambiante ou à 37 ° C
- Laver 3x avec PBS-Tween
- Incuber 1 heure à température ambiante avec de la protéine 3 (si elle existe) + 0,1% de SAB
- Laver 3x avec PBS-Tween
- Incuber 1 heure à température ambiante avec de la protéine 4 ou un anticorps, qui est conjugué à - peroxydase (dilué la protéine conjuguée à la peroxydase ou un anticorps 1/1000 avec du PBS-Tween) + 0,1% de SAB
- Laver 5-6x avec du PBS-Tween
- solution de développement (5mg ABTS dans 10 ml de tampon A + H2 10uL O2). faire juste avant l'utilisation et de garder dans l'obscurité avant utilisation
- Attendre 15 minutes (mettre une feuille autour d'elle pour empêcher la lumière d'atteindre it)
- Lire la microplaque avec un lecteur de plaque à 405 nm