Le clonage et l'analyse moléculaire des gènes

Le résultat d'une expérience de clonage qui commence par l'ADN total à partir d'une source spécifique est une bibliothèque de clones. Ainsi l'ARNm de clonage par un intermédiaire d'ADNc génère une bibliothèque d'ADNc qui représente l'ARNm à partir de ce stade de développement spécifique. En revanche, si vous cloner l'ADN humain totale par exemple dans un lambda ou un vecteur cosmide, vous obtenez une banque génomique qui contient (avec une probabilité de 95-99%) toutes les séquences du génome humain ou complément d'ADN. bibliothèques Lambda ou cosmides sont généralement utilisés pour les bibliothèques génomiques parce que vous pouvez généralement cloner un gène entier contenant à la fois la séquence codante et éléments régulateurs sur un seul clone.

L'un des éléments clés pour identifier un gène pendant le clonage est une sonde. Une sonde est normalement une pièce clone d'ADN qui contient une partie de la séquence pour lequel vous êtes à la recherche. Vous généralement faire radioactif de la sonde et l'ajouter à une solution. Les filtres contenant des clones immobilisés sont ensuite baignés dans la solution. Le principal derrière cette étape est que la sonde se lie à une séquence contenant clone similaires à ceux trouvés sur la sonde. Cette étape de liaison est appelée hybridation.

• Sonde - un acide nucléique (habituellement l'ADN) qui est complémentaire d'un gène spécifique ou une séquence d'acide nucléique d'intérêt; quand une banque d'ADNc est projeté un anticorps peut être utilisé pour identifier la protéine qui est exprimée par l'insert du clone
• Homologue Probe - une sonde qui est exactement complémentaire de la séquence d'acide nucléique pour lequel vous êtes à la recherche; ex. un ADNc humain utilisé pour rechercher une bibliothèque génomique humaine
• Sonde hétérologue - une sonde qui est similaire à, mais pas exactement complémentaire de la séquence d'acide nucléique pour lequel vous êtes à la recherche; ex. une sonde de souris utilisé pour rechercher une bibliothèque génomique humaine

Criblage d'un ADNc ou bibliothèque génomique

1. immobiliser les membres de la bibliothèque sur une membrane de nylon et de les dénaturer pour qu'ils soient à simple brin
2. préparer une sonde radiomarquée et dénaturer pour le rendre simple brin
3. hybrider la sonde à la bibliothèque de clones
4. laver l'excès de sonde et d'exposer un film à rayons X
5. isoler le clone positif et analyser

L'étape d'hybridation est effectuée à une température non stricte qui assure la sonde se liera à un clone contenant une séquence similaire. En même temps, une hybridation non spécifique se produira parce que certains des clones contiendra limitée, mais pas une similarité significative à la sonde. L'étape de lavage est effectuée à une température rigoureuse qui est suffisamment élevée pour laver la sonde hors tension tous les clones auxquels il a lié de manière non spécifique. Mais il est important que la température ne soit pas si élevée qu'elle lave la sonde au large des clones qui contiennent des séquences qui sont similaires ou identiques à la sonde elle-même. Par conséquent, l'examen de la source de la sonde (homologue ou hétérologue) déterminer la température à laquelle l'étape de lavage est effectuée.