Méthodes bactériennes endotoxines pharmaceutiques Directives d'essai
L'addition d'une solution contenant des endotoxines dans une solution du lysat produit une turbidité, une précipitation ou une gélification du mélange. Cependant, l'addition d'un substrat chromogène à une solution de résultats de lysat dans le développement de la couleur due à la libération de chromophore du substrat lors de l'activation par l'endotoxine présente dans la solution. La vitesse de réaction dépend de la concentration d'endotoxine, le pH et la température. La réaction nécessite la présence de certains cations bivalents, un système d'enzyme de cascade de la coagulation et de protéines capables caillot, qui sont tous fournis par le lysat.
Les quantités de endotoxines sont exprimées en unités d'endotoxines définies (UE). Avec l'adoption de la deuxième norme internationale pour les endotoxines par le Comité d'experts sur les normes biologiques de l'Organisation mondiale de la Santé, 1EU = 1 UI.
La limite d'endotoxine pour une préparation d'essai donné est calculé à partir de l'expression K / M, où M est la dose maximale administrée à un adulte (70 kg considéré comme à cet effet) par kg par heure. La valeur de K est de 5,0 EU / kg pour les préparations parenterales à l'exception de ceux qui sont administrés par voie intrathécale, et est de 0,2 EU / kg pour les préparations destinées à être administrées par voie intrathécale.
(A) dans le cas des procédés gel-caillot, la sensibilité du lysat;
(B) dans le cas des méthodes quantitatives, la linéarité de la courbe d'étalonnage;
(C) l'absence de facteurs interférant, qui inhibent ou favorisent la réaction ou autrement interférer avec le test sur la préparation en cours d'examen;
(D) le caractère adéquat des récipients pour résister à l'adsorption d'endotoxines.
Réactifs spéciaux
norme de référence endotoxines et de contrôle endotoxine standard.
Le endotoxine de référence standard (ERS) est le lyophilisé, endotoxine purifiée d'Escherichia coli, qui est calibrée en endotoxines unités (UE) par rapport à la norme internationale.
L'endotoxine étalon de référence (CAR) ou tout autre préparation appropriée dont l'activité a été déterminée par rapport à l'ERS ou la norme internationale à l'aide d'un gel-caillot ou une autre méthode appropriée.
L'endotoxine lyophilisée doit être reconstituée avec de l'eau BET en mélangeant de façon intermittente pendant 30 minutes en utilisant un mélangeur vortex. Le concentré doit être stocké dans un réfrigérateur pour ne pas plus de 28 jours. dilutions ultérieures du concentré doivent être fabriqués en mélangeant vigoureusement pendant au moins 3 minutes avant utilisation. Chaque dilution doit être mélangé pendant au moins 30 secondes avant de procéder à la dilution suivante.
Un lysat de amœbocytes de l'une des espèces du limule, Limulus polyphemus, Tachypleus gigas, Tachypleus tridentatus ou Carcinoscorpius rotundicauda reconstitué comme indiqué sur l'étiquette. L'espèce à partir de laquelle le lysat est obtenu est indiquée sur l'étiquette.
Eau BET:
0,1 M d'acide chlorhydrique BET: Préparation de l'acide chlorhydrique avec de l'eau BET. Après ajustement du pH de 6,0 à 8,0 avec de l'hydroxyde de sodium 0.lM BET il donne un résultat négatif dans les conditions de l'essai.
0,1 M d'hydroxyde de sodium BET: Préparation de l'hydroxyde de sodium avec de l'eau BET. Après ajustement du pH à 6,0 à 8,0 avec l'acide chlorhydrique 0,1M BET donne un résultat négatif dans les conditions du test.
pH du tampon Tris-chlorure 7,4 BET .: Dissoudre 0,6057 g de tris (hydroxyméthyl) méthylamine dans 30 ml d'eau BET, ajouter 0,33 ml d'acide chlorhydrique, dilué à 100 ml avec de l'eau et mélanger BET. Il donne un résultat négatif dans les conditions du test.
Les méthodes suivantes peuvent être utilisées pour surveiller la concentration d'endotoxine dans un agent de produit dans la pharmacopée et pour déterminer si le produit est conforme à la limite spécifiée dans la monographie.
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