Modélisation de la pneumonie à staphylocoques dans un système de modèle de tissu pulmonaire humain 3D toxine-médiation définit
1 Département de médecine Huddinge, Karolinska Institutet, Centre de médecine infectieuse, S-141 86 Stockholm, Suède
2 CIRI, Centre international pour la recherche infectiologie, Inserm, U1111, CNRS UMR5308, Universit # x000e9; Lyon 1, # X000c9; cole Normale Sup # x000e9; de Lyon rieure, 69008 Lyon, France
3 Centre national de référence français pour les staphylocoques, les Hospices Civils de Lyon, 69677 Bron Cedex, France
4 Département de microbiologie, Moyne Institut de médecine préventive, Trinity College, Dublin 2, Irlande
* Ces auteurs ont participé à ce travail à part égale
Cet article a été cité par d'autres articles dans PMC.
MOTS CLÉS: Staphylococcus aureus. Pneumonie, modèle de tissu pulmonaire 3D
INTRODUCTION
IMPACT DE TRANSLATION
En exposant le tissu pulmonaire humain 3D spécifiques S. aureus exotoxines produites par la pneumonie isolats cliniques, cette étude démontre que les niveaux élevés de # X003b1; endommager directement l'toxine-épithélium pulmonaire et que PVL contribue à une lésion tissulaire indirectement par la lyse des neutrophiles. De plus, l'étude a montré que la pathologie tissulaire plus grave est provoquée par la combinaison de fortes concentrations de # X003b1; et PVL toxine-. De même, une collection de souches cliniques de S. aureus de personnes souffrant de pneumonie a révélé que l'issue fatale est liée à la production élevée de toxine et une cytotoxicité élevée. En outre, # X003b1; inflammation induite et PVL et toxine-forte régulation positive de chimiokines, provoquant par la suite augmenté la migration des neutrophiles. Notamment, les deux # X003b1; -toxin- et les effets cytotoxiques à médiation par PVL et des dommages aux tissus ont été complètement abrogée par l'application d'immunoglobuline intraveineuse polyclonal (IVIG) à une concentration physiologique.
Les implications et les orientations futures
Supérieur cytotoxicité et la pathologie accrue des tissus provoquée par des toxines sécrétées par nécrosante isolats de pneumonie
Les isolats cliniques de S. aureus et plasmides utilisés dans cette étude
cytotoxicité bactérienne à médiation surnageant et lésions du tissu épithélial. (A, B) a été déterminé par Cytotoxicité mesures de LDH évaluées dans le surnageant de neutrophiles (A) et les cellules épithéliales pulmonaires (16HBE) (B) exposés à surnageants bactériens préparés.
# X003b1, perturbe directement l'toxine-épithélium dans les modèles de tissus pulmonaires
Pour déterminer si l'expression différentielle du # X003b1; récepteur ADAM10 pourrait expliquer toxine-la sensibilité variable à # X003b1; cytolyse à médiation toxine-, l'expression de surface de ADAM10 sur les cellules épithéliales pulmonaires, les fibroblastes pulmonaires et neutrophiles a été analysé par cytométrie en flux. En accord avec la sensibilité des différents types de cellules, la plus haute expression de ADAM10 a été observée avec des cellules épithéliales pulmonaires, suivie par les fibroblastes, alors que les neutrophiles ont exprimé les niveaux les plus bas (figure #, de x000a0. 2 F). Dans le tissu pulmonaire, ADAM10 a été abondamment exprimé et, en accord avec les données de cytométrie en flux, une expression plus élevée a été observée dans la couche épithéliale stratifiée que dans la couche stromale fibroblaste (figure # x000a0;. 2 G).
PVL contribue indirectement à des lésions épithéliales pulmonaires par cytotoxicité à médiation neutrophile-
PVL contribue à des lésions épithéliales pulmonaires par cytotoxicité à médiation neutrophile. (A) Notation de la sévérité histologique des modèles de tissus pulmonaires exposés à des surnageants de culture de LE2332 ou NP753, les neutrophiles non traités (PMN) et / ou PMN exposés LE2332. Le .
toxines S. aureus induisent une nécrose des tissus, une augmentation des réponses inflammatoires et chimiokines dans les modèles de tissu pulmonaire
Les réponses inflammatoires et chimiokines déclenchées par surnageants de culture staphylocoques et les toxines pures. modèles de tissus pulmonaires exposés à surnageants de culture de NP796, NP753, LE2332, USA300 ou toxines pures ont été sectionnées et colorées par immunohistochimie.
Pour explorer davantage comment cela influence la migration des neutrophiles, nous avons testé les milieux de culture récoltés à partir de modèles stimulés de tissu pulmonaire dans un essai de migration Transwell. Comme le montre la figure # x000a0;. 4 G, médias de S. aureus -exposed modèles de tissus induite par la migration des neutrophiles qui ont dépassé celle du contrôle positif, et les réponses les plus élevées ont été observées avec des surnageants bactériens de la pneumonie nécrosante isole. En outre, les deux surnageants de PVL- et # X003b1; toxine-traité modèles de tissu pulmonaire a stimulé une forte réponse chimiotactique sur une large plage de concentrations et dans une plus grande mesure que le témoin positif (Fig # de x000a0;. 4 H).
# X003b1; et la production PVL toxine-pneumonie clinique de S. aureus isolats se rapportent à la cytotoxicité et les résultats cliniques
Pris ensemble, les données suggèrent que la pathologie tissulaire plus grave est provoquée par l'action combinée de # X003b1; et PVL toxine-. Pour tester cela dans un matériau clinique, nous avons analysé un ensemble de 31 souches de pneumonie CA (tableau # de x000a0, S2) pour la production et la cytotoxicité toxine. Une corrélation positive entre # X003b1; niveaux et cytotoxicité vers toxine-cellules épithéliales du poumon (P # X0003c; 0,0001) a été noté, alors que les niveaux PVL en corrélation avec la cytotoxicité envers les neutrophiles (P # X0003c; 0,001) (Fig # x000a0;. 5 A). Dans les modèles de tissu pulmonaire exposés, les lésions était significativement corrélée avec les niveaux de # X003b1, présent dans les toxine-surnageants bactériens (P # X0003c; 0,006) (Fig # x000a0;. 5 B). De même, les lésions épithéliales médiée par les neutrophiles en corrélation, en particulier avec les souches exprimant des niveaux élevés de PVL (P # X0003c; 0,001) (Fig # x000a0;. 5 C). En divisant les souches selon les résultats cliniques ont montré que les souches de non-survivants ont provoqué une cytotoxicité plus élevée contre les cellules épithéliales du poumon (P # X0003c; 0,05) et de neutrophiles (P # X0003c 0,05) que les souches de survivants (Fig # de x000a0;. 5 D). cytotoxicité élevée vers les cellules épithéliales et neutrophiles était significativement plus fréquente (50% contre 10%) parmi les souches associées à une issue fatale (P # X0003c; 0,001) (Fig # x000a0;. 5 E). Analyse de # X003b1, et les niveaux PVL toxine-produits par des souches de non-survivants et les survivants ont montré des niveaux significativement plus élevés de PVL dans des souches de non-survivants et une tendance à des niveaux plus élevés de # X003b1; toxine-(Fig. # X000a0; 5 F).
Les concentrations de toxines et de l'activité cytotoxique dans les surnageants de la pneumonie nosocomiale (CA) isole. Une collection de pneumonie CA isolats (n = 31) a été analysé pour les niveaux de toxines et de l'activité cytotoxique dans les surnageants de culture bactérienne. (A) La corrélation de.
lésion épithéliale médiation est-Toxine bloqué par IgIV
DISCUSSION
MATÉRIAUX ET MÉTHODES
Les souches bactériennes
toxine tests ELISA
Les cultures de cellules et des dosages de stimulation
Cytométrie de flux
Tous les types de cellules ont été colorées avec anti-ADAM10-PE (BioLegend, San Diego, CA, USA) conjugué et par rapport à leur contrôle isotypique. La fluorescence a été détectée par une analyse de cytométrie en flux en utilisant les mêmes paramètres laser pour tous les différents types de cellules.
système de modèle de tissu pulmonaire 3D
L'analyse histologique et immunomarquage
Imagerie en temps réel des modèles de tissu pulmonaire 3D
HMGB1 et CXCL8 ELISA
Les niveaux de HMGB1, CXCL8, TNF # x003b1; et l'IL-1 # x003b2; dans les surnageants de modèles de tissus pulmonaires stimulés ont été mesurés par CXCL8 humaine, TNF # x003b1; et l'IL-1 # x003b2; ELISA Quantikine (R # x00026 de D Systems) et HMGB1 humaine ELISA (international IBL) selon les instructions du fabricant. Tous les échantillons ont été analysés en double.
Transmigration chimiotaxie dosage
analyse par transfert Western
analyses statistiques
Remerciements
Nous remercions Dr Ranganathan Iyer chez Global Hôpitaux, Hyderabad, en Inde pour fournir de bien vouloir les souches NP796, NP753 et LE2332. L'assistance technique habile fournie par Yvonne Benito, Michele Bes, Florence Couzon et Cédric Badiou (CIRI, Centre international pour la recherche infectiologie, Inserm) Nous tenons à remercier. Nous sommes reconnaissants à BioM # x000e9; rieux et GSK vaccins pour fournir les anticorps nécessaires à PVL et # X003b1; ELISA toxine-respectivement. Cette étude a été, en partie, réalisée à l'unité d'imagerie en direct cellulaire, Département des sciences biologiques et de la nutrition, Karolinska Institutet.
SMS. MME. et A.N.-T. conçu l'étude; SMS. P. C. A.T.N.H. H. B. F.V. N.S. et I.R.M. conçu et réalisé des approches expérimentales; SMS. T.J.F. F.V. GÉORGIE. MME. et A.N.-T.wrote le papier; SMS. P. C. A.T.N.H. F.V. N.S. I.R.M. T.J.F. GÉORGIE. MME. et A.N.-T. analyser et interpréter les expériences; et F.V. G.L. GÉORGIE. et T.J.F. réactifs et fourni des outils d'analyse. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
L'étude a été soutenue par des subventions du Karolinska Institutet (AN-T.), Conseil du comté de Stockholm (MSAN-T.), Commission européenne (7e PC-santé 305340-2), le Conseil suédois de la recherche (AN-T.), La Suède Programme Liens de recherche (AN-T.), Knut et Alice Wallenberg Foundation (AN-T.), et le Programme science Foundation Ireland chercheur accorde 08 / IN.1 / B1845 (TJF).
Les références
Articles de modèles de la maladie # X0026; Des mécanismes sont offerts à titre gracieux de la Compagnie des Biologistes