Protocole blot inverse dot (RDB)
dot blot inverse (RDB)
l'analyse dot-blot inverse est une technique d'immobilisation des sondes d'oligonucléotides spécifiques d'allèles sur une membrane de nylon, plutôt que les échantillons d'ADN individuels. Ceci est une méthode non radioactive. Dans ce format, plusieurs paires de sondes ASO mutants et normaux sont repérés sur des bandes de membranes en nylon. Pour chaque test de diagnostic, une bande repéré contenant de nombreux oligonucleotides normaux et mutants, est hybridée avec une sonde d'ADN spécifique pour cribler de nombreuses mutations. analyse dot-blot inverse a été décrit par Saiki et al (22), puis développé plus tard à l'écran de nombreuses mutations de ß-thalassémie dans la population sicilienne et pour une utilisation dans le diagnostic prénatal (23,24).
Le dot-blot inverse peut détecter les plus courants et des mutations spécifiques rares présentes dans un pays déterminé après que les conditions sont soigneusement mis en place. Pas simple RDB peut couvrir toutes les mutations dans tous les pays. RDB est également utilisé pour analyser en Sicile α-thalassémie (25) et des mutations ponctuelles δ-thalassémie, et pour le génotypage des principales variantes de gène de ß-globine (HbS, HbC, HbD, etc). Un aperçu général de la méthode est décrite.
- L'ADN amplifié est marqué en utilisant des amorces modifiées en 5’ avec la biotine ou au cours de l'amplification par la biotine-16-dUTP.
- Les sondes oligonucléotidiques sont 5' amino-modifié. Un groupe NH2 est ajouté au cours de la dernière étape de la synthèse.
- Membrane (Biodyne-C, PALL-Biosupport) est activé par EDC et la sonde oligonucléotidique est déposée sur la surface de la membrane en utilisant une pipette de 2 uL. A gauche et à droite de la même voie sont pointées à la normale et les oligonucléotides mutants.
- Après inactivation de la membrane, il est pré-hybridée pendant 15 min à 45 ° C
- L'ADN amplifié est dilué dans une solution d'hybridation et dénaturé à 95 ° C pendant 10 minutes. Ensuite, il est ajouté à la membrane pré-hybridée.
- Les membranes sont incubées pendant 60 min. à 45 ° C et ensuite lavé pendant 20 minutes à 45 ° C
- l'étape de conjugaison avec de la streptavidine-AP est effectuée pendant 30 min à température ambiante.
- Les membranes sont lavées pendant 15 min à température ambiante.
- Enfin, les filtres sont incubés dans une solution contenant NBT / BCIP et la couleur est développée en 30-45 min.
Une exigence critique de cet essai est l'optimisation de la température de lavage unique pour toutes les sondes. Cette exigence est mieux contrôlée par l'optimisation de la longueur et de la quantité de chaque sonde oligonucléotidique. Cela nécessite généralement la synthèse et le procès de plusieurs sondes. Dans certains cas, l'addition ou la deletion d'un seul nucleotide de la séquence de la sonde oligonucléotidique est critique pour le typage correct. Les bandes de membrane contenant les sondes d'oligonucléotides liés de manière covalente peuvent être préparés en grandes quantités et stockées prêt à être utilisé à la température ambiante pendant six mois.
Interprétation des résultats
Il est important de souligner qu'il doit y avoir une différenciation entre les faux positifs en raison de signaux de fond et les vrais résultats positifs des échantillons témoins. En cas de doute le test doit toujours être répété. La stratégie, comme ARMS-PCR, est à l'écran pour les mutations communes sur une membrane et ensuite, si on obtient aucun résultat positif, les rares sont criblés pour une deuxième membrane. est ensuite étudié toute mutation non identifiée par séquençage restant direct.
La figure 5.2 montre illustre les principales étapes impliquées dans la génération d'une inversion Dot Blot en utilisant une sonde immobilisée ASO.
La figure 5.3 montre RDB utilisé pour dépister les 7 mutations les plus fréquentes trouvées en Sicile (comme indiqué dans le tableau 5.3). Celles-ci représentent 95% des défauts β-thalassémie en Sicile.
La figure 5.4 montre RDB utilisé pour le diagnostic prénatal de la β-thalassémie dans le laboratoire du Dr Maggio en Sicile.
Figures 5.5 et 5.6 montrent RDB utilisé pour détecter des mutations α-thalassémie et de point δ- thalassémie dans le laboratoire du Dr Maggio.