L'état actuel de clonage d'ADNc
Le clonage des ADNc, des copies de l'ARN cellulaire, est l'une des technologies classiques de la biologie moléculaire. Au cours des 30 dernières années des technologies de clonage d'ADNc ont été améliorées pour permettre le clonage de grandes collections d'ADNc, qui sont fondamentales pour la compréhension actuelle de l'utilisation de l'information génétique. Avec la découverte des ARN non codants, de nouvelles approches supplémentaires pour le clonage des ARN courts ont été développés. Cependant, la prise de conscience que des portions beaucoup plus de génomes sont transcrites que prévu d'annotations du génome, le clonage d'ADNc fait face à de nouveaux défis pour découvrir les transcriptions rares et pour rendre les ADNc correspondant disponibles pour des études fonctionnelles. Cet examen donne un aperçu sur l'état actuel du clonage de l'ADNc et les possibilités pour la découverte et la caractérisation de nouvelles familles d'ARN.
- clonage de l'ADNc;
- la banque d'ADNc;
- ARNm;
- Petit ARN;
- ARN non codante;
- Clonage d'expression
introduction
le clonage d'ADNc est l'une des technologies fondamentales de la biologie moléculaire, et la plupart de nos connaissances sur les relevés de notes et des protéines est dérivée de la capacité de préparer des copies d'ADNc à partir d'ARN et de les cloner dans des banques d'ADNc. A partir de la découverte de transcriptases inverses, différents protocoles pour la construction de la banque d'ADNc ont été développés au fil du temps. L'amélioration de la préparation de la bibliothèque ont contribué à la découverte des gènes et la création de grandes ressources génomiques. Les découvertes récentes de nouvelles classes d'ARN et transcrits exprimés à des niveaux très bas exigent de nouvelles approches de clonage d'ADNc pour rendre ces ARN disponibles pour l'analyse fonctionnelle. Bien qu'il soit au-delà de la portée de cet article pour examiner tous les développements techniques des 30 dernières années, des étapes clés dans la préparation banque d'ADNc sont traités pour mettre en évidence les principes généraux du clonage d'ADNc (Fig. 1) et de donner un aperçu sur l'état actuel de clonage d'ADNc et orientations futures.
clonage d'ADNc classique. Les étapes clés pour la préparation d'une banque d'ADNc sont présentés. Pour plus de détails sur chaque étape, reportez-vous au texte.
transcriptases inverses et la synthèse d'ADNc du premier brin
La conversion enzymatique de l'ARN en ADNc double brin est devenu courant depuis la découverte des transcriptases inverses en 1970 [1] # Xa0 ;; # Xa0 [2]. et l'amélioration des conditions de synthèse de l'ADNc sont devenues disponibles en 1975 [3]. transcriptases inverses sont des ADN-polymérases ARN et ADN-dépendantes qui peuvent utiliser soit de l'ARN ou de l'ADN pour amorcer la synthèse d'ADN. Les préparations commerciales de virus de la leucémie aviaire et la souche Moloney virus de la leucémie murine (Mo-MLV) la transcriptase inverse sont couramment utilisés aujourd'hui, et la suppression de l'activité de RNase H de Mo-MLV transcriptases inverses en outre des rendements d'ADNc améliorés [4]. De plus, l'addition de gène de bacteriophage T4 32 protéine (T4gp32) peut stimuler la synthèse d'ADNc longs [5] et le tréhalose augmente la fidélité de l'enzyme et permet la synthèse d'ADNc à des températures plus élevées [6] # Xa0 ;; # Xa0 [7].